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1、第三章 病毒与亚病毒第一节 病毒的性质第二节 病毒的研究方法第三节 病毒复制第四节 病毒的非增殖性感染第五节 亚病毒第六节 病毒的可利用价值,第一节 病毒的性质,一、形态结构二、病毒的化学组成三、病毒的理化抗性,一、形态结构1.形态和大小 形态多样,100nm以下。2.结构：核(衣)壳+核酸或包膜（来源于核膜或细胞膜）。,衣壳对称类型,二、化学组成,（一）病毒的核酸（DNA或RNA）1.正极性和负极性正极性(+RNA)：可作为mRNA。负极性(-RNA)：与其mRNA序列互补。双意RNA：正极性+负极性。DNA：和mRNA互补-DNA；和mRNA序列相似+DNA。2.感染性核酸（infecti
2、ous nucleic acid）抽提分离的病毒核酸导入细胞产生子代毒粒。,（二）病毒的蛋白质 含量多（40-90%）；种类少（一种或几种）。1.结构蛋白 如壳体蛋白、包膜蛋白，主要是保护、参与识别和吸附。2.功能蛋白 如溶菌酶、转录酶等、主要参与侵入、释放或复制。,（三）、脂类和糖类都来源于细胞；种类和含量同于宿主细胞（磷脂+胆固醇）;注：少数无包膜病毒（T系噬菌体、噬菌体等）也有脂类。,三、理化抗性 1.温度耐冷不耐热，离体，5660，30min灭活。保存：低温真空干燥法(-20-196)；适量盐溶液（MgCl2，MgSO4）可提高热稳定性。2.射线击毁病毒核酸。活性染料（如甲苯胺兰、中性
3、红、丫啶橙）渗入并与核酸结合可见光灭活。3.pH：5.09.0稳定。,4.脂溶剂 破坏包膜，如乙醚、氯彷分类的依据。5.化学消毒剂 对氧化剂（如高锰酸钾、次氯酸盐）敏感；酒精、酸碱、环氧乙烷可杀灭。6.抗生素 不敏感，但患病须注射。,第二节 病毒的研究方法,一、分离与纯化二、效价测定,一、分离纯化,（一）分离1.标本采集与除菌处理（1）采集：有足够活病毒。如倒罐液，感染者血液、分泌物等。（2）除菌处理 采用抗生素、离心、过滤等。,2.接种与感染表现（1）接种考虑宿主范围、组织嗜性；操作简单、易培养、易判断。注：盲传：第一次接种未出现症状，重复接种。目的：提高效价。盲传二代后，仍未症状无活病毒。
4、,（2）感染表现 噬菌斑、坏死斑（枯斑）、蚀斑（空斑）。噬菌斑（plaque）噬菌体平板培养物圆形的透明区域。有一定的形态，用于分离、鉴定和计数。,噬菌斑,坏死斑（枯斑）植物病毒敏感植物叶片坏损区域。蚀斑（空斑）动物病毒细胞单层上病损区。细胞内部发生“致细胞病变效应”（细胞聚集成团、肿大、融合成多核细胞，有包涵体或裂解）。,包涵体(inclusion body)光镜下可见、圆形、卵圆形或不定形的蛋白质结晶。组成多为病毒颗粒或病毒亚基；少为细胞对感染的反应产物，无病毒粒子。实践应用病毒诊断大小、形态、数量、组成以及位置快速鉴别辅助诊断。用于生物防治昆虫病毒多角体（碱性蛋白）杀虫。,（二）、病毒的
5、纯化1.标准（1）保持感染性；（2）大小、形态、密度、组成及抗原性均一。2.方法盐析、等电点沉淀、凝胶层析、离子交换等；超速离心,二、效价测定,效价：指1mL培养液或试样中病毒感染单位数目（噬菌斑形成单位数或感染中心数）。1.物理颗粒计数：电镜。2.感染性测定：测噬菌斑、枯斑(须用石英砂摩擦叶片)和蚀斑数。,噬菌斑,37，12h,双层平板法,第三节 病毒复制一、病毒的增殖过程二、一步生长曲线（one-step growth curve）,一、病毒的增殖过程（E.coli T4噬菌体）吸附、侵入、生物合成、装配和释放。（一）吸附 1.特异性 吸附蛋白（VAP）细胞受体（细胞生长必须）。2.原理：
6、空间结构的互补性，氢键、疏水性相互作用、范德华力。,（二）侵入1.噬菌体：注射。2.动物病毒直穿细胞膜；细胞内吞：累积在细胞质的小泡内释放；膜融合：包膜和细胞膜融合。3.植物病毒：伤口或口器侵入。,（三）生物合成 1.特点：时序性。早期转录次早期转录晚期基因表达。以E.coli的T偶数双链噬菌体为例。,早期mRNA,早期蛋白(次早期RNA聚合酶),次早期mRNA,次早期蛋白(DNA分解酶、DNA、mRNA聚合酶等),晚期mRNA,晚期蛋白(衣壳蛋白、装配酶等),核酸(DNA)复制,次早期DNA,2.核酸复制（1）基本规律双链为半保留，单链先合成互补链，再复制。（2）病毒DNA或RNA的复制双链
7、DNA和双链RNA复制（半保留复制）单链+DNA和+RNA复制 先合成负链，再合成正链。单链-RNA复制-RNA+RNA(即mRNA)-RNA。逆转录病毒单链RNA复制RNA DNA 双链DNA 单链RNA。,（四）、装配（五）、释放 裂解和出芽。,二、一步生长曲线（描述烈性噬菌体的复制）1.具体操作敏感菌+噬菌体（10/1)。噬菌体抗血清去除游离噬菌体。将培养液高倍稀释终止抗血清作用。定时取样0.5mL+0.5mL敏感菌悬液+5mL半固体培养基混匀37培养，12h观察测定噬菌斑数。绘制一次生长曲线（以感染时间为横坐标，噬菌斑数为纵坐标）。,2.三个特征数据：潜伏期，裂解期和裂解量。裂解量=稳
8、定期病毒效价/潜伏期病毒效价,第四节 非增殖性感染与缺损病毒,侵染后，不产生有感染性子代病毒粒子。一、非增殖性感染的类型1.流产感染(abortive infection)2.限制性感染(restrictive infection)3.潜伏感染(latent infection),1.流产感染,（1）依赖于细胞,不能复制,如：人肾细胞允许人腺病毒；猴肾细胞非允许。,（2）依赖于病毒,病毒基因组不完整（缺损病毒）。,2.限制性感染 细胞瞬时允许，病毒不能复制或仅有少数细胞产生病毒。如：人乳头瘤病毒，感染各分化期的上皮细胞，不能晚期转录。感染分化成熟的鳞状上皮细胞晚期转录。3.潜伏感染在细胞内，不
9、产病毒，不破坏细胞。可由病毒基因表达，改变宿主恶性细胞。,二、缺损病毒 主要为基因组有缺陷，须依赖其他病毒才能复制。1.干扰缺损病毒(干扰缺损颗粒)(defective interfering particles)DI颗粒2.卫星病毒3.条件缺损病毒 4.整合的病毒基因组,1.DI颗粒复制时产生的基因缺失突变体。各病毒均可产生，在高感染复数(m.o.i)时产生频率最高。m.o.i：每一敏感细胞表面吸附病毒的数量。m.o.i=1-300须依赖于同源完全病毒才能复制，但基因组小，干扰完全病毒复制。,2.卫星病毒 绝对缺损，形态结构、抗原性与辅助病毒不同，少有同源性。,3.条件缺损病毒 条件致死突变
10、体，在允许条件正常增殖；非允许条件流产感染或死亡。4.整合的病毒基因组 温和噬菌体和肿瘤病毒。（1）温和噬菌体（核酸都是dsDNA）有游离噬菌体（游离态）、原噬菌体（整合态或质粒形式）和营养噬菌体（营养态）三种存在形式。,（2）溶源菌 特征溶源性可遗传可（自发或诱发）裂解有免疫性复愈：辐射或氮芥处理，有些菌体会失去原噬菌体。溶源转变：除免疫性以外获得新性状。局限转导,检出方法紫外线照射；将少量溶源菌和大量敏感菌混合，倒平板培养，观察。出现独特噬菌斑溶源菌。,敏感菌菌苔,溶源菌菌落,透明裂解斑,（3）肿瘤病毒的整合感染 肿瘤病毒（如乙肝病毒）或RNA病毒，一定条件下可转入复制循环，产生子代病毒。
11、DNA病毒：直接整合。RNA病毒：如逆转录病毒。,第五节 亚病毒一、卫星RNA（拟病毒）单链RNA片段，在辅助病毒衣壳内，无单独侵染性。与辅助病毒无明显同源性。二、类病毒 有单独侵染性，单链环状RNA。（其RNA无mRNA活性）,三、朊病毒：独立复制、无免疫性的疏水性角蛋白。1982年，美，prusiner发现1996年诺贝尔奖。引起的疾病：疯牛病（牛海绵状脑病）；羊痒疫（羊搔痒症）；人的克-雅氏症（老年痴呆症）等。,第六节 病毒的可利用价值,1.疾病防治 防治痢疾杆菌、耐药性的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。2.清除藻类污染3.防治害虫和植物病害：多角体、真菌病毒，卫星RNA等。4.基因工程工具酶：聚合酶、连接酶、核苷酸激酶等。,练习题,1.名词：烈性噬菌体、噬菌斑、枯斑、蚀斑、包涵体、致细胞病变效应，噬菌体的效价、一步生长曲线、温和噬菌体、卫星病毒、朊病毒、溶源菌，溶源转变、感染性核酸、干扰缺损病毒、整合感染、中和作用。2.病毒的非增殖性感染有哪几类，引起的原因是什么？3.一步生长曲线包括哪几个时期，各时期的特点是什么？4.温和噬菌体的三种存在形式及溶源菌的特性。5.包涵体有哪些应用？,6.如何测定样品中噬菌体的效价？7.某发酵工厂生产菌株经常因噬菌体“感染”而不能正常生产，在排除了外部感染的可能性后，有人认为是由于溶源性菌的裂解所致，你的看法如何？请设计一个实验证明。,
