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1、聚合酶链式反应(PCR)及引物设计,Content,聚合酶链式反应（PCR）的技术原理及实验操作PCR引物设计软件的使用（Primer Premier 5.0）,聚合酶链式反应（PCR）,实验目的,了解PCR的基本原理掌握PCR的基本操作技术 学习引物设计的原则及引物设计软件Primer5的使用,聚合酶链式反应（PCR）,实验原理,PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用,PCR技术原理,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR
2、不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。,PCR技术原理,以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。,正义链,反义链,PCR技术原理,模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。Tm-5C,在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA94C,从结合在特定DNA模板
3、上的引物为出发点，按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链72C,变性,退火,延伸,PCR技术原理,PCR出现的问题：PCR扩增未得到目的条带？扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？扩增的目的条带很弱？,引物是否合适?,引物设计是PCR 技术中至关重要的一环,实验原理,PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用,引物设计的原则,引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。,基本原则：,引物长度（primer length）产物长度（product length）
4、序列Tm 值(melting temperature)形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值在错配位点（false priming site）的引发效率引物及产物的GC 含量（composition）,引物设计的原则,具体因素：,引物设计的原则,一般原则：,1.引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5）Tm值的计算：一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)2.引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。,引物设
5、计的原则,3.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。4.引物3端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A5.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。,引物设计的原则,6.引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；,发夹结构,引物二聚体,实验原理,PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用,1.缓冲液：10 50 mM Tris-Cl(pH8.4)维持 Taq 酶作用环境 25 50 mM KCl 促进引物退火 100g/ml 牛血清白蛋白(BSA)对
6、酶有一定的保护性 0.5 2.5 mM MgCl2 Taq 酶具有 Mg2+依赖性2.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP底物 0.5 2.5 M,PCR的成分和作用,3.引物(Primer-P)：预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。0.1 1 M 4.模板DNA(Template):最低102 105 DNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1 5 l,PCR的成分和作用,5.Taq DNA 聚合酶 耐高热 0.5 5 U/100 l 1U/25 50l6.水：去离子水，补足整个反应体积。,PCR的成分和作用,实验原理,PCR技术原理引物设计的原则PCR的
7、成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用,常用30l 各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。,PCR反应体系,操作：5份标本 总体积 30l 6=180l 1.取一 0.5 ml Ep 管，加入下列试剂：10buffer：3l 6=18l dNTPs:1.0l6=6.0l 引物P1：1.0l 6=6.0l 引物P2：1.0l 6=6.0l Taq 酶(5U/l)：0.2l 6=1.2l 水：22.8l 6=136.8l 共174l，先用移液器/指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。,PCR反应体系,冰上操作！,2.另取 5
8、 支0.2ml PCR管，分别加入上述液体29l。3.分别取标本模板各1l，加入上述5支PCR 管中，混匀，离心机瞬时离心，备用。4.反应条件：PCR扩增仪,PCR反应体系,945,94 30 60 30 72 130个循环,72 5,实验原理,PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用,变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热9095，30 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 30，可使各种复杂的DNA分子完全变性。,PCR反应条件优化
9、,退火温度和时间：PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。退火温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，一般位于40 60，30 60 s。退火温度越高，产物特异性越高。退火温度越低，产物特异性越低。设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！,PCR反应条件优化,延伸温度和时间：延伸温度一般位于Taq酶最适作用温度70 75 之间，常用72 延伸时间，可根据待扩增片段的长度和使用的Taq酶而定，一般taq酶的扩增效率是1kb/1min 延伸时间过长可出现非特异扩增。,PCR反应条件优化,循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20 25次循环后，PC
10、R产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20 30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。,PCR反应条件优化,实验原理,PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用,1、目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR的应用,3、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴
11、血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、基因转录水平检测RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,PCR的应用,聚合酶链式反应（PCR）,实验仪器、试剂及耗材,实验仪器及耗材 PCR仪、移液器、0.2 mL PCR管、各种规格的吸头。,实验仪器、试剂及耗材,实验试剂 10PCR buffer(Mg2+Plus)；dNTP mix(2.5 mM each)；Taq DNA Polymerase(2U/L)；引物：CKB-F/CKB-R，引物溶液浓度为10
12、M；CKB基因模板质粒:（购自YRBIO基因库）；无菌超纯水；琼脂糖。,聚合酶链式反应（PCR）,实验步骤,准备PCR反应溶液，取0.2 mL PCR管，按以下顺序加入各试剂：PCR反应体系 无菌超纯水 38 L 10buffer 5.0 L dNTP mix 2.5 L 引物CKB-F 1 L 引物CKB-R 1 L 模板 2 L Taq酶 0.5 L 合计 50 L,实验步骤,调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。反应程序：94 5 min；94 30 sec；60 30 sec；721min 10 sec；30个循环，最后72延伸10 min。每人做一管，反应
13、完毕后，各取3 L进行琼脂糖凝胶（1.0%）电泳检测。,聚合酶链式反应（PCR）,实验结果及讨论,PCR结果。12、PCR产物（3ul样品）,PCR常见问题,1.无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解退火温度太高,2.非特异性扩增,PCR常见问题,引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多退火温度偏低循环次数过多,PCR常见问题,3.拖尾,产物在凝胶上呈Smear状态,M 1 2,模板不纯或降解Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,4.假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),交叉污染,PCR常见问题,对策,操作时
14、防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。各种试剂先进行分装，低温贮存。设置阳性和阴性对照，重复实验,Content,聚合酶链式反应（PCR）的技术原理及实验操作PCR引物设计软件的使用（Primer Premier 5.0）,常用的引物设计软件,Primer Premier 5.0（自动搜索）*Oligo 6（引物评价）*Vector NTI SuitDnasisOmigaDnastar,Primer Premier 5.0 简介,主要功能:1、引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分
15、析,Primer Premier 5.0使用介绍,Preimer Premier 启动界面,Load sequence,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好,Choose a function,引物设计界面,引物设计界面,First you can design the primer manually,Sense strand or anti-sense strand,
16、Useful information of the primer,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,搜索结果,28对引物,引物评分100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer,引物编辑,引物编辑,编辑引物,分析引物结果,确认编辑的引物,引物设计实例,扩增CKB基因CDS区片段（1.2KB）亚克隆到pEGFP-N1载体，构建真核表达载体pEGFP-N1-CKB,引物设计实例,查找CKB基因(NM_00
17、1823)序列及CDS区序列分析待扩增片段和载体的酶切位点，选择合适的克隆位点Primer5.0 软件设计引物,酶切位点分析,CKB CDS Non-cutting enzymes:BamHI,BglII,BsaI,EcoRI,EcoRV,HindIII,KpnI,MluI,NheI,NotI,PacI,PmeI,SalI,SpeI,SphI,XbaI,XhoI使用软件：DNAstar,载体图谱,基因的终止密码子必须去除！保持插入基因和载体的读码框一致！,CKB(EcoRI-BamHI)：CKB-f：5-ATGCCCTTCTCCAACAGCCA-3-Kozak序列：GCC ACC-EcoRI：G GAATTC-final primer：5-G GAATTC GCC ACC ATGCCCTTCTCCAACAGCCA-3 Length=33CKB-r：5-TTTCTGGGCAGGCATGAGGT-3-保持读码框完整性：CG-BamHI：CG GGATCC-final primer：5-CG GGATCC CG TTTCTGGGCAGGCATGAGGT-3 Length=30product：Length=1.2kb，GC%=64.1，Ta=60.6,Thank You!,
