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1、生物技术综合实验Comprehensive Experiments of Biotechnology,主要内容 Contents：一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction四、DNA序列测定 DNA Sequencing五、分子杂交技术 Molecular Hybridization Southern,Northern and Western Blot六
2、、基因文库和cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆与表达 Heterogenic Gene Cloning and Expression八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein,DNA序列测定DNA sequencing,Walter Gilbert Frederick Sanger1975 DNA sequencing developed:Walter Gilbert and Allan Maxam of Harvard University
3、 and Fred Sanger of Cambridge University simultaneously come up with two techniques for determining the exact sequence of bases that make up a gene.Gilbert and Sanger share the 1980 Nobel Prize(also with Paul Berg).,一、概述,DNA序列测定技术，是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能够分离长度达到300500个碱基，而差别仅1个碱基的单链
4、寡聚核苷酸。技术由三部分组成 1 产生不同长度的DNA片段,差别仅1个碱基。2 在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。3 测序胶的放射性自显影技术。,末端终止法 Sanger-Coulson(dideoxy or enzymatic)sequencing化学裂解法 Maxam-Gilbert(chemical)sequencing,测序方法,末端终止法原理,利用E.coli polymerase I以单链DNA为模板，以dNTP和-32p-dATP为底物合成互补的DNA链。当反应遇到双脱氧的核糖核苷酸底物（ddNTP）时，掺入到新生的DNA链中，但是该双脱氧的核糖核苷酸的掺入阻止了DNA链进一步的延伸
5、反应，形成了长短不同的DNA片段。通过电泳和放射自显影读出DNA序列。,3-5 phosphodiester bond,PPi(pyrophosphate)or diphosphate,DNA 合成的底物 deoxynucleoside 5-triphosphatesdNTP(dATP,dGTP,dCTP&TTP),dATP,Phosphodiester bonds in DNA,5,3,3-5 Phosphodiester bridge or 3-5 phosphodiester bond,DNA polymerase I fragment(Klenow),Taq DNA polymeras
6、e,Sequenase(T7 phage DNA polymerase modified)Substrate dNTP,-32p-dNTP,or-35s-dATP ddNTP,DNA sequencing,dCTP,ddCTP,H,H,Dideoxy Sequencing of DNA,proceeding for DNA synthesis:,H,ddATP,Reaction Requirements forDideoxy Sequencing of DNA,1.DNA template:Single-stranded DNA molecule(template)to be sequence
7、d2.Primer:Oligonucleotide primer complementary to upstream region of template3.DNA ploymerase:4.Substrates:All four dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)One of dNTP is labeled with radioactive isotope.5.One of the four ddNTPs(ddATP,ddGTP,ddCTP,or ddTTP)are needed in each reaction volume.,Reaction Requirements
8、forDideoxy Sequencing of DNA,Dideoxy Sequencing of DNA,The four separate sequencing ractions are loaded onto a polyacrylaimde gel and resolved by electrophoresisThe primer or one of the four dNTPs are radioactively labeledAn x-ray film is exposed to the gel producing an autoradiogramThe autoradiogra
9、m is“read”from the bottom up.,（一）测序反应：1.对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4备用。2.对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂：（1）样品反应：质粒模板DNA 2.1pmol；5测序缓冲液 5ml；引物 4.5pmol；无菌ddH2O 至终体积16ml。,（2）对照反应：pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg)4.0 l；5测序缓冲液 5l；pUC/M13正向引物(4.
10、5pmol)3.6l；无菌ddH2O至终体积16l。3.在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0l测序级Taq DNA聚合酶(5u/l)。用吸液器吸动几次混匀。4.从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4l加入每一个d/ddNTP混合物的管内。5.在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。,6.把反应管放入预热至95的热循环仪，以注意中循环模式为基准，开始循环程序。每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。7.热循环程序完成后，在每个小管内加入3l DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。注意 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：模板种类/长度
11、模板量 200bp(PCR产物)16ng 3000-5000bp（超螺旋质粒DNA)4mg 48000bp(,粘粒DNA)1mg,由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：4.5pmol=1.5ngn,其中n为引物碱基数 计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式：dsDNA:1pmol=(6.610-4 mg)n,n为模板碱基对数 ssDNA:1pmol=(3.310-4 mg)n,n为模板碱基数 3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物热循环仪必须预热至9
12、5。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。,模式1：适用于引物24碱基或GC含量50%95 2分钟。然后：95 30秒(变性),42 30秒(退火),70 1分钟(延伸)。模式2:适用于24碱基或略短的GC含量50%的引物。95 2分钟,然后:95 30秒(变性),70 30秒(退火/延伸)。4.在加入终止溶液之后样品可在4保存过夜。（二）、测序凝胶板的制备1、玻璃板的处理：测序的玻璃板一定要先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经硅化油处理可防
13、止凝胶撕裂。,（1）短玻璃板的处理 A.在1ml 95%乙醇,0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane),配成新鲜的粘合溶液。B.用浸透新配的硅烷的吸水棉擦拭清洗并自然干燥玻璃板,整个板面都必须擦拭。C.4-5分钟后,用95%乙醇单向擦玻璃板,沿垂直方向擦拭。重复三次,每次均须换用干净纸,除去多余的粘合溶液。注意 1.在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷,使凝胶不能很好地粘附。2.准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的,否则将导致凝胶撕裂。,(2)、长玻璃板的处理 A.用浸Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗
14、过的长玻璃板。B.5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。注意 1.用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10%NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染，用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开，如果出现交叉污染，以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。,2、凝胶的制备：（1）玻璃板经硅化油处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓
15、度可获得较好的结果。配制时，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，加入过硫酸铵和TEMED。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。,凝胶终浓度 3 4 5 6 8 12 16 18 尿素(g)42 42 42 42 42 42 42 42 Acr&Bis(ml)7.5 10 12 14 20 30 40 50 10TBE缓冲液(ml)10 10 10 10 10 10 10
16、10 双蒸水(ml)47.5 45 43 40.5 35 25 15 5 10%过硫酸铵(ml)0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 TEMED(l)87 80 80 80 80 70 47 40,(3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。注意 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。,（三）电泳：,1、预电泳（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加
17、样孔。（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。（3）稀释10TBE缓冲液至1TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的,热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。（5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防
18、止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。注意（1）.用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。（2）.应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。,2、样品的制备：当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4-6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。,3、上样及电泳 关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，
19、去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长，0.2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。,注意 1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散
20、。电泳中可进行恒功率电泳。,第二节 T7 DN A聚合酶测序技术,一、概述：T7DNA聚合酶最初具有53聚合酶活性以及单链和双链35外切酶活性。当T7DNA聚合酶用适当方法处理后，可使35外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA聚合酶又称T7测序酶。使用T7测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此,放射自显影所得到的结果较为清晰易辩.。对于许多模板来说,使用含有dGTP的混合物即可得到理想的测序结果。然而,如果出现了带压缩的问题，则用含dITP的混合物来取代常规的dGTP。dITP的掺入，使在富含GC的模板中也能有效地消除带压缩现象。,T7测序酶具有很高的聚合速度，并
21、有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Klenow片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止，然而对于有紧密二级结构的区域,错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况，应使用一些高温DNA聚合酶，如Promega公司的测序级Taq DNA酶。利用高温DNA聚合酶独有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。,T7 DNA聚合酶测序的快速而简便的方法是从Klenow酶和AMV反转录酶测序的操作步骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的5-3的DNA合成活性和极低的3-5端外切酶的活性。在测序过程中，若以同位素标记则比Klenow大片段或反转录酶AMV效果好，可使条带非
22、常的均一，并且它的放射性背景极低。,T7 DNA聚合酶测序时，DNA的合成是分二步完成的。第一步为标记反应，第二步方为双脱氧链末端终止的DNA合成过程。在第一步过程中，引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应过程中，已含有经放射性标记的dATP。第二步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸，DNA在合成过程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止，形成长短不一的DNA片段。二、材料：待测的DNA模板，可用双链或单链模板。,三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，照相显影用大号塑料盆，制胶设备，吹风机，放射自显影盒，X-光片。四、试剂 1、5T7 DN
23、A聚合酶缓冲液：200mmol/L TrisCl,pH7.5,100mmol/L MgCl2,250mmol/L NaCl。2、引物：使用通用引物pUC/M13正向或逆向引物。3、DTT：0.1mol/L。4、5常规标记混合物：7.5mmol/L dGTP,7.5mmol/L dCTP,7.5mmol/L dTTP。5、5dITP标记混合物：15mmol/L dITP,7.5mmol/L dCTP,7.5mmol/L dTTP。,6、dNTP A溶液（适用于dGTP):80mmol/L dGTP,80mmol/L dATP,80mmol/L dCTP,80mmol/L dTTP,50mmol/
24、L NaCl。7、ddG终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddGTP。8、ddA终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddATP。9、ddT终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddTTP。10、ddC 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddCTP。,11、dNTP B溶液（适用于dITP):160mmol/L dITP,80mmol/L dATP,80mmol/L dCTP,80mmol/L dTTP,50mmol/L NaCl。12、ddG终止混合物(适用于dIT
25、P)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddGTP。13、ddA 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddATP。14、ddT 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddTTP。15、dd C终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddCTP。,16、T7 DNA测序酶。17、酶稀释缓冲液：10mmol/L TrisHCl,pH7.5,5mmol/L DTT,0.5mg/ml BSA。18、终止溶液：95%甲酰胺，20mmol/L EDTA,0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯兰。19、-32P
26、dATP 或-35S-dATP,35S的优点是可使条带为窄而清晰，并且操作更为安全。放射强度为：1000-1500Ci/mmol，10mCi/ml。20、TE缓冲液：21、凝胶制备过程中的全套试剂。22、X光显影液：H2O：50 800ml，米吐尔 2.2g，无水Na2SO3 72g，对苯二酚 8.8g，无水NaCO3 48g,KBr 4g，定容至1000ml备用。,23、F-5坚膜定影液：水600ml,Na2S2O3 240g,Na2SO3 15g,冰醋酸 13.4ml；硼酸 7.5g，粉状钾矾15g，定容至1000ml 备用。,五、操作步骤：,（一）、模板制备 1、M13单链模板制备：在转
27、化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG的培养基上铺板之后,含有M13重组子的细胞将表现出无色的噬菌斑，事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死，出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的细菌慢的缘故,从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模板。（1）过夜培养的宿主细胞(如JM101)用3ml TYP肉汁培养基以1:100稀释。在37强烈震荡1小时之后,细胞进入对数早期。此时,将一个合适的含有重组M13的噬菌斑(连同琼脂)用滴管转入该细胞培养液中。,（2）37强烈震荡(300rpm)培养6小时。（3）把细胞培养液转入两只1.5ml epp
28、endorf管,12000g离心15分钟。上清液转移到新的eppendorf管再离心15分钟。小心地取出1-1.2ml上清液(注意不能触及沉淀),再转到新的eppendorf管。（4）将0.25体积的含20PEG(-8000)的3.75M醋酸铵(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌体。混匀后置冰上30分钟,再以12000g离心15分钟,倾去上清液,再以同样方法离心一次,用吸液器尖头将残留的PEG充分吸干净。此时应能见管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。,（5）将沉淀物重溶于400ml TE缓冲液中。（6）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液,强烈震荡1分钟，12000g离心5分钟。（7）将水相转入一
29、新的eppendorf管,注意不能触动原管中两相交界面。加等体积苯酚/氯仿(1:1)混合液,强烈振荡1分钟,12000g离心5分钟。（8）将上层水相转入另一新的eppendorf管,重复第7步的提取,如有必要重复多次直至二相之间无可见物质存在。（9）将上层水相转入一新的eppendorf管,加等体积氯仿,强烈振荡1分钟后,12000g离心5分钟,多次重复此步骤。（10）将上层水相转入新的eppendorf管,加0.5倍体积的7.5 mol/L 醋酸铵,2倍体积乙醇,混匀后-20放置 30分钟。,（11）12000g离心15分钟,去除上清液,用70乙醇小心清洗沉淀,如果沉淀已被搅起,重新离心,倾
30、去酒精,真空干燥沉淀物。（12）将DNA的沉淀物溶解于20ml去离子水中，取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳定量,如果DNA量充足,则可进行退火测序。2、噬粒(Phagemid)单链模板的制备：噬粒是指含有丝状单链DNA噬菌体复制区的嵌合质粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和pGEM系列的质粒均属噬粒。含重组噬粒的细胞单菌落经液体培养并用辅助噬菌体超感染后就能产生测序反应所需的单链DNA模板。,（1）从新鲜平板上挑得含pGEM质粒DNA的抗Amp单菌落,并接种到100ml含有50mg/ml氨苄的TYP肉汤培养基中,在37振荡过夜。（2）取100ml过夜培养物接种到另一新的装有5ml 含
31、50mg/mlAmp的TYP肉汁培养基的试管中,在37强烈振荡30分钟。（3）加40l辅助噬菌体R408或M13 K07,继续剧烈搅拌振荡培养6-8小时，使辅助噬菌体超感染。（4）12000g离心15分钟后，去除沉淀，取上清，转移到一新eppendorf管中再次离心15分钟,小心地取1-1.2ml上清液(注意不能触及沉淀)。,（5）将0.25体积的含20 PEG-的3.75M醋酸铵加入上清液以沉淀噬菌体颗粒。混匀后置冰上30分钟,再以12000g离心15分钟,倾去上清液,再以同样方法离心一次,用移液器尖头将残留的PEG溶液吸净。此时应能看到管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。（6）将沉淀物溶解于4
32、00ml TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)。（7）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液,强烈振荡1分钟,再以12000g离心5分钟。（8）将水相转入一干净eppendorf管,加等体积酚/氯仿(1:1)混合液,强烈振荡1分钟,12000g离心5分钟。（9）上层水相转入一干净eppendorf管重复第8步骤,如有必要重复多次直至二相之间无可见物质。,（10）将上层水相转入一干净eppendorf管加等体积氯仿,强烈振荡1分钟后离心,多次重复此步骤。（11）将上层水相转入一干净eppendorf管加0.5倍体积7.5mol/L pH7.5醋酸
33、铵,再加2倍体积乙醇,混和后-20放置30分钟。（12）12000g离心15分钟,去除上清液,用70乙醇小心清洗沉淀,如沉淀已被搅起,重新离心,倾去乙醇,真空干燥沉淀。（13）将沉淀物溶解于20ml去离子水中,取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳进行定量，如果DNA量充足，则进行退火和测序。3、质粒膜板制备：参照以前所述的方法。,（二）超螺旋质粒DNA的碱变性,1、取4mg（约2pmol）超螺旋质粒DNA至一eppendorf管中，加无离子水到终体积18ml。2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液,置于室温(25下）保温5分钟。3、加2ml 2mol/L NaAc溶液
34、(pH4.6)涡旋混匀，使之中和。4、加75ml无水乙醇，充分混匀后，置于干冰或-70沉淀10分钟。5、于12000g离心10分钟，弃去上清，用200ml预冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml无离子水中。,（三）、测序反应：,1、引物和模板的退火：（1）在一离心管中，混合如下几种试剂：引物 约1-2pmol 5T7 DNA聚合酶测序反应缓冲液 2ml DNA 约1mg 加ddH2O终体积至10ml。（2）将试管盖盖上后，65加热2分钟，然后在大约30分钟左右的时间内，使试管的温度缓慢地降到室温。降温的过程中可使用小的加热板或小型的保温仪，也可使用已调至65的水浴，使它们的温度在室温下
35、缓慢地降至室温即可。当温度降至30以下时，退火结束。可将小试管置于冰上，退火完毕的模板须在4小时内使用。,2、标记反应（1）在一个标准的反应过程中（从引物处开始，可读到500个碱基以上），首先需要按1:5稀释标记混合物。如4ml混合物则加双蒸无离子水16ml。该稀释液储存在-20可使用数周。如果所要测定的序列小于30个碱基，可将标记缓冲液稀释15倍，同时，模板DNA要高于0.5pmol。由于DNA模板量的不足，会降低标记反应的程度，即只标记引物后的几个核苷酸。（2）用冰预冷的TE缓冲液按1:8稀释T7DNA聚合酶。酶液稀释后应立即使用，置于冰浴不宜超过60分钟。不得使用标记混合物、DTT溶液或
36、非缓冲液类溶液稀释酶液。（3）在已退火的引物-模板混合物中，依次加入,0.1mol/L DTT 1.0ml 标记混合物 2.0ml-32PdATP或-35SdATP 0.5ml 已稀释好的T7 DNA聚合酶 2.0ml混合充分（注意不得产生气泡），置于室温5-10分钟。如果在电泳时碰到带压缩问题，则dITP 混合物的效果优于dGTP混合物，dITP混合物的使用方法与dGTP混合物的使用是相似的。,注意 1、稀释时应将所有的溶液预先混合完全后再加入酶液。2、在第（3）步的过程中，如果反应中有几次冷却，保温的时间过长或温度太高的话，则会使测序反应短于100个碱基。3、链终止反应：（1）取4支epp
37、endorf管分别标上G，A，T，C。（2）每个管分别加入2.5ml G，A，T，C链末端终止混合物，立即盖上盖子以防液体蒸发（本反应最好在标记反应前做好）。dGTP和dITP混合物依据各自需要选用。（3）将eppendorf管预热至37 1分钟。,（4）待标记反应完毕后，取3.5ml标记反应液至上述4支eppendorf管中，稍微离心一下，并将上述四管置于37保温。注意在每一次反应中，均应使用新的吸液头，以免交叉污染。（5）继续保温3-5分钟（若使用dITP时，保温时间可延长至30分钟，对反应产物没有任何影响。（6）在上述四管中各加入4ml终止缓冲液。混合均匀后，置于冰浴中。本样品即可上样电
38、泳。用35S标记反应的样品可置于-20保存一周，此时样品只有极少量的降解。而32P标记的则需在当天电泳以免降解。,（四）测序凝胶板的制备及电泳 参考第一节测序凝胶板的制备及电泳部分。样品加热至75-80 2分钟，立即上样，每个泳道的使用量为2-3l。（五）测序凝胶板的干燥及放射自显影。电泳完毕后，经32P或35S标记的产物可用对-射线敏感的X-光胶片放射自显影检测。1、取下电泳的玻璃板，去除两边的压条，用小的薄钢片撬开玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷处理过，凝胶会紧紧地粘合于玻璃板上，则凝胶与玻璃板一起进行下面步骤的处理。如果玻璃板没有经过粘合硅烷的处理，则可用3MM大滤纸贴在有凝胶的玻璃板上，小心
39、地揭下凝胶，准备下一步的处理。,2、去除尿素，将含有凝胶的玻璃板或滤纸浸于含有2升10%冰醋酸的大号显液盆中，轻轻振荡15分钟，去除尿素。3、干胶：含有凝胶的玻璃板可用电吹风吹干，而含有凝胶的滤纸则可用专用的干胶设备如真空加热干胶仪抽干。4、已经干燥的凝胶即可进行放射自显影。在玻璃板含有凝胶的这一面加上X-光片后，用另一块相似大小的玻璃板夹住，然后用夹子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝胶的滤纸则可置于X-光曝光盒中放射自显影。一般32P曝光过夜即可，而35S为2-3天。,5、曝光完毕后的X-光片即可冲洗，获得序列信息。将X光片置于水中先湿润，然后置于显影液中显影，直至条带清晰显示为止。X-光片用
40、水淋洗片刻后置于定影液中定影15分钟以上。取出X-光片干燥并读出序列。注意 1、去除尿素是非常重要的，如果有残存的尿素，则在干胶过程中会使凝胶很粘，而无法进行放射自显影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15分钟，第二次10分钟。如果胶浓度高于12%，则有可能在干胶过程中会产生皱纹，防止的方法有二种：（1）冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油；,（2）不干燥胶，直接在冰箱中以冰冻状态曝光，应注意的是在使用这个方法时，要在凝胶和X-光片之间加一层薄的塑料薄膜。一般来说都使用第一种方法。2、凝胶一定要充分干燥方可进行曝光，否则X-光片会粘在胶的表面，致使以后的操作困难。3、曝光时间应根据所使用的同位素而
41、定，如果同位素已过半衰期则应相应延长曝光的时间。思考题：1、测序结果的基本原理是什么？主要影响因素是什么？应如何消除？2、如何获DNA测序胶板上的DNA序列的信息？,Some thoughts on designing primers.,1.primers should be 17-28 bases in length;2.base composition should be 50-60%(G+C);3.primers should end(3)in a G or C,or CG or GC:this increases efficiency of priming;4.Tms between
42、55-80oC are preferred;5.3-ends of primers should not be complementary(ie.base pair),as otherwise primer dimers will be synthesized preferentially to any other product;6.primer self-complementarity(ability to form 2o structures such as hairpins)should be avoided;7.runs of three or more Cs or Gs at th
43、e 3-ends of primers may promote mispriming at G or C-rich sequences(because of stability of annealing),and should be avoided.preferential,DNA sequencing,1.primer self-complementarity(ability to form 2o structures such as hairpins)should be avoided;2.primers should not be complementary,otherwise prim
44、er dimers will be synthesized preferentially to any other product;,DNA sequencing,dATP dATP dATP dATP dCTP dCTP dCTP dCTP dGTP dGTP dGTP dGTP dTTP dTTP dTTP dTTP+ddATP ddCTP ddGTP ddTTP A C G T,GTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCCTTTCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCCTTTGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCCTTGTTTTTGCTC
45、TACTAGGTTATGCCGGTCCTGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGCGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGGTTTTTGCTCTACTAGGTTATGTTTTTGCTCTACTAGGTTAGTTTTTGCTCTACTAGGTTGTTTTTGCTCTACTAG
46、GTGTTTTTGCTCTACTAGGGTTTTTGCTCTACTAGGTTTTTGCTCTACTAGTTTTTGCTCTACTGTTTTTGCTCTACGTTTTTGCTCTAGTTTTTGCTCTGTTTTTGCTCGTTTTTGCTGTTTTTGCGTTTTTGGTTTTTGTTTTGTTTGTTGTG,5GAAAGGACCGGCATAACCTAGTAGAGCAAAAAC33CTTTCCTGGCCGTATTGGATCATCTCGTTTTTG5,二、DNA序列的自动测定的基本原理和操作方法,2.1 基本原理 由英国剑桥分子生物学实验室生物化学家Sanger等人1977年创建的利用DNA聚合
47、酶和双脱氧核苷酸末端终止法测序已成为现今自动测序的最佳选择方案。,2.2 其独特性在于：带4种不同荧光染料的双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂，而替代了手工测序的同位素标记。采用聚丙烯酰胺区分长度仅差1个碱基的单链DNA。一个样品的4个测序可以在一个泳道内电泳，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。电泳之后，就可以通过全自动激光激发以及荧光检测而直接“读出”碱基顺序。,2.3 组成 包括电泳系统、激光检测装置、电脑、彩色打印机、DNA序列分析软件及DNA片段大小和定量分析软件。该系统采用电脑单点控制整个DNA测序仪，包括电泳参数设置、数据收集、分析及结果输出。电脑可在电泳过
48、程中对仪器运行状态进行同步检测，电泳结果可以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。,When the desired product is obtained,it will be sequenced by the Central Services Lab,Sequencing,Applied Biosystems PRISM 377(Gel,34-96 lanes),Applied Biosystems PRISM 3100(Capillary,16 capillaries),Applied Biosystems PRISM 3700(Capillary,96 capilla
49、ries),化学裂解法的原理,首先对待测的DNA片段进行单侧末端标记，将标记后的DNA片段分成4-5个反应体系，分别用不同的化学试剂处理，使DNA片段分别于某一种或某一类碱基处断裂。使得平均每个DNA分子只在一个位置被裂解，而切断裂的位置随机发生在DNA片段某种碱基中的任何一个上。,The Cy-5 group showed reasonable stability towards most chemical reagents used in the Maxam-Gilbert protocol.The cleavage of Cy-5-labeled DNA at G-sites(dimet
50、hyl sulfate)or at A+G sites(piperidine formate)was especially effective;almost no fluorescence was lost after cleavage.Modification of DNA with hydrazine(cleavage at C or C+T)resulted in the loss of approximately half of the fluorescence during the course of incubation;to compensate for this,gels we
