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1、柯萨奇病毒的,RT-PCR,实验室诊断,柯萨奇病毒,?,?,属于小病毒科肠道病毒属，最易在灵长类动物细胞中生长。,病毒分为、两组。柯萨奇病毒组有个血清型，柯萨奇病毒,组有个血清型。,?,单股正链,RNA,，全长大约,7.4Kb,，,病毒直,径为,25,30nm,，球形，无包膜，病毒衣壳,由,VP1-VP4,等构成，呈,20,面体立体对称。,柯萨奇病毒,(Coxsackie virus,，,CV),的诊断方法：,?,病毒分离、动物接种,操作烦琐,成功率低,影响诊断的敏感性；,?,ELISA,法,检测患者血清中相应的特异性,IgM,、,IgG,抗体,但不,能获得有关病毒更多的信息；,?,RT-,P
2、CR,法,既可以通过检测病人样本中的病毒,RNA,来明确诊断,也可以通过进一步的测序来分析病毒流行株特定序,列,为基因分型提供依据。,两端为保守的非编码,区，中间为编码区。,5,端共价结合一小分,子蛋白质,Vpg,（约,7kDa,），与病毒,RNA,合成和基因组装配有,关；,3,端带有,polyA,尾。编码区编码的病,毒结构蛋白,VP1,VP4,，,VP1,、,VP2,和,VP3,均暴露在病毒衣,壳的表面，有中和抗,原位点；,VP4,位于衣,壳内部，一旦病毒,VP1,与受体结合后，,VP4,即被释出，衣壳,松动，病毒基因组脱,壳穿入。,?,逆转录,PCR,，或者称反转录,PCR(reverse
3、,transcription-PCR,RT-PCR),，是聚合酶链式反,应,(PCR),的一种广泛应用的变形。在,RT-PCR,中，,由一条,RNA,单链转录为互补,DNA(cDNA),称作,“逆转录”，由依赖,RNA,的,DNA,聚合酶（逆转,录酶）来完成。一条,RNA,链被逆转录成为互补,DNA,，再以此为模板通过,PCR,进行,DNA,扩增。,Types of RT-PCR Reactions,?,Standard RT-PCR usually with one-step(recommended),Sensitive and specific,?,Nested PCR,More sens
4、itive than standard,Contamination is a major problem,Only for very experienced labs,?,Real Time RT-PCR,Sensitive and specific,Reagent and equipment costs are a factor,High throughput,RT-PCR,实验程序：标本的采集、标本,RNA,的提取、引物、,RT-PCR,反应体系、,温度循环参数、琼脂糖电泳、凝胶成像、结果判定及序列测定,?,一步法：反转录,PCR,在一个管子里完成，得到,的全部,cDNA,产物都一起经,P
5、CR,扩增，灵敏度,更高。,两步法：反转录和,PCR,分开，灵活而且严谨，,但灵敏度不如前者高。,?,RNA,操作注意事项,?,全程戴手套,?,灭菌、清洁的塑料管或无,RNA,酶的玻璃制品,?,高压带滤芯枪尖,?,RNA,提取试剂要保证无,RNA,酶,?,所有试剂开盖时要标明日期,?,在,RNA,提取、,RT-PCR,和测序过程中使用无,RNA,酶水,?,操作快捷，提取后的,RNA,应放在,-70,度,?,备有冰盒，全程中保持,RNA,在低温状态下,?,避免反复冻融,RNA,，防止,RNA,降解。,PCR,反应系统的组成：,耐热,DNA,聚合酶（,Taq,酶）：这是由耐热水生细菌,体内提取的一
6、种,DNA,聚合酶。,模板,DNA,：即待分析的目的,DNA,，其长度不宜大于,10kb,。,两种引物：为了保证,DNA,聚合酶能够对两条互补链,均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补,模板,DNA,链的,3-,端。,四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的,dNTPS,。,缓冲溶液：保证,DNA,聚合酶催化时所需的适当的溶,液,pH,值,?,?,PCR,技术类似于,DNA,的天然复制过程，其特异性依赖于与,靶序列两端互补的寡核苷酸引物。,PCR,由变性,-,退火,-,延伸三,个基本反应步骤构成：,模板,DNA,的变性：模板,DNA,经加热至,93,左右一定时间后，,使模板,DNA,双链或经,PC
7、R,扩增形成的双链,DNA,解离，使之成,为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,模板,DNA,与引物的退火,(,复性,),：模板,DNA,经加热变性成单,链后，温度降至,55,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列,配对结合；,引物的延伸：,DNA,模板,-,引物结合物在,TaqDNA,聚合酶的,作用下，以,dNTP,为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与,半保留复制原理，合成一条新的与模板,DNA,链互补的半保留,复制链。重复循环变性,-,退火,-,延伸三过程，就可获得更多的,“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。,每完成一个循环需,2,4,分钟，,2,3,小时就能
8、将待扩目的基因,扩增放大几百万倍。到达平台期,(Plateau),所需循环次数取决,于样品中模板的拷贝。,PCR,注意事项,?,?,?,?,?,?,PCR,关键环节,模板,;,引物,;,酶,dNTP,;,循环条件,;,寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。,模,板,1,、杂质蛋白质；特别是染色体中的组蛋白；,2,、,Taq,酶抑制剂；,3,、在提取制备模板时丢失过多；,4,、模板核酸变性不彻底；,5,、模板降解。,RT-PCR,的关键步骤是在,RNA,的反转录，要,求,RNA,模版为完整的且不含,DNA,、蛋白质等,杂质。,引,?,物,?,?,?,?,引物质量、浓度、两条引物的浓度是否对称，是
9、,PCR,失败,或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引,物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，,造成低效率的不对称扩增，对策为：,选定一个好的引物合成单位,;,引物的浓度不仅要看,OD,值，更要注重引物原液做琼脂,糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮,度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此,时做,PCR,有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一,条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。,引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰,箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。,引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚,体等。,2
10、+,Mg,酶,?,Mg,2+,浓度：,Mg,2+,离子浓度对,PCR,扩增效率影响很,大，浓度过高可降低,PCR,扩增的特异性，浓度过,低则影响,PCR,扩增产量甚至使,PCR,扩增失败而不,出扩增条带。,酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。,物理原因,?,?,变性对,PCR,扩增来说相当重要，如变性温度低，,变性时间短，极有可能出现假阴性,;,退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异,性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的,结合而降低,PCR,扩增效率。,出现片状拖带或涂抹带,PCR,扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其,原因往往由于
11、酶量过多或酶的质量差，,dNTP,浓度,过高，,Mg,2+,浓度过高，退火温度过低，循环次数,过多引起。其对策有：,1,、减少酶量，或调换另一来源的酶；,2,、减少,dNTP,的浓度。适当降低,Mg,2+,浓度。增加模,板量，减少循环次数；,3,、减少模板量。,?,?,?,如何避免污染,?,?,?,?,?,严格分区：标本处理区与,PCR,扩增区、产物分析区，要有,一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：体,系配制 标本制备,PCR,扩增产物分析产物处理。,试剂：引物和探针尽量分装，不要原瓶多次取用。,加样：原则是模板最后加，其他试剂按照体积从大往小的,加。操作多份样品时，制备反应混合液
12、，先将,dNTP,、缓,冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，,避免污染，又可以增加反应的精确度。,耗材：使用一次性吸头，严禁与,PCR,产物分析室的吸头混,用；,PCR,产物：机器运行完后，取出,PCR,产物时不能随便丢弃，,应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。,?,?,TRIZOL,法提取核酸,RT-PCR,法检测柯萨奇病毒（两步法）,?,?,?,逆转录（,RT,）,聚合酶链反应（,PCR,）,PCR,产物的检测和鉴定,?,引物：,CVB3,的,3D,基因引物,?,TRIZOL,法提取核酸,1,）取,250ul,病毒悬液加到,1.5ml,离心管中，然后加入,750ul
13、TRIZOL,溶液，混,匀,5,秒后离心。,2,）加入,200ul,氯仿溶液，充分混匀,5,秒钟,3,）室温放置,10,分钟后，,10000RPM,，室温离心,20,分钟,4,）将上清液转移到一支新的,1.5ml,离心管中,5,）再加入,500ul,异丙醇溶液，摇匀,10,秒钟,6,）室温静置至少,15,分钟,7,）,14000RPM,，,4,离心,25,分钟,8,）倒掉上清液，加入,950ul,冰冷的,70%,乙醇,9,）,14000RPM,，,4,离心,20,分钟,10,）用吸尖小心吸出上清液倒掉,11,）室温干燥后加入,15ul dH2O,，,-70,保存,?,逆转录（,RT,）,配液：
14、,RNA 3l,（,1g,）,随机引物,1l,加水至,10l,混匀，瞬时离心，,70,5min,立即冰水浴，瞬时离心，依次添加下列试剂,M-MLV Buffer 5,4l,dNTP 10mM,1l,M-,MLV 200U/l,1l,加水至,20l,，混匀，瞬时离心，,42,15min,；,95,5min,；,4,维持。,cDNA,于,-20,冰箱冻存。,聚合酶链反应（,PCR,）,配液：,25ul,体系,2,mix,12.5,PrimerA(100ug/ml)1ul,PrimerS(100ug/ml)1ul,cDNA,1ul,ddH2O,9.5ul,?,?,反应程序：,95,95,60,72,
15、72,4,5min,15sec,20sec,35cycles,20sec,10min,保存,?,PCR,产物的检测和鉴定,1,）取,100ml,电泳缓冲液（,1,TAE,）加入到干净的三角瓶中，再加入,1.7g,琼,脂糖粉末，轻轻摇动三角瓶，是琼脂糖微粒呈均匀混浊状态。,2,）微波炉加热使琼脂糖熔化。,3,）熔化的琼脂糖自然冷却到,60,左右，加入,5ul,溴化乙锭（,EB,），混匀后,倒入已准备好的胶床中，凝胶厚度约为,0.3,0.5cm,。,4,）室温下静置，凝胶固化。拿出已经做好的胶，将带凝胶的胶床置于电泳,槽中。,5,）向电泳糟中加入电泳缓冲液（,1,TAE,），缓冲液的量以超过凝胶表
16、面,1-,2mm,为宜。,6,）核酸样品,5ul,中加入大约,1ul,的,6,loading buffer,，用加样器轻轻混合均匀。,7,）用加样器吸取样品，轻轻加入到凝胶的样品孔中。,8,）根据指示剂（溴酚蓝）迁移的位置判断是否终止电泳，如可以终止，则,切断电源取出凝胶。,9,）凝胶成像仪观察电泳条带，保存记录。,1,：逆转录,30min,所得模板；,2,：逆转录,30min,所得模板稀释,100,倍；,3,：逆转录,15min,所得模板；,4,：逆转录,15min,所得模板稀释,100,倍；,5,：,Marker,；,6,：阳性对照；,7,：阴性对照；,8,：空白对照。,谢谢观看！,2020,
