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1、膜磷脂脂肪酸图谱分析(Phospholipid Fatty Acid Profile)代谢指纹技术(群落水平生理特征图谱Biolog)Metabolic fingerprinting techniques-Community level physiological profiles(CLPPs),微生物群落结构分析,膜磷脂脂肪酸分析,微生物特异磷脂脂肪酸,脂肪酸分子通式：X:YZ（c/t）X：脂肪酸分子的总碳原子数；Y：烯键的数目；：双键的位置（从羧基端起计）;后缀c和t分别表示顺式和反式同分异构体,a(anto):前异构甲基支链;cyc:环丙基支链;i(iso):异构甲基支链;Me:甲基支链
2、,在生物体中的浓度恒定：不随种类、生长条件和生理状态而变化,应用细胞中特异化学成分的前提,该物质仅存在于活的生物体中，在死亡微生物体或非生物的有机物质中量很小,磷脂脂肪酸仅存在于活细胞的细胞膜中，死亡细胞膜磷脂被迅速分解,容易从细胞和土壤中提取出来；有测定该物质灵敏、准确的方法,PLFAs可从土壤中直接提取出来，并用气相色谱测定其总量及种类,特定微生物具有特异性PLFAs，膜磷脂脂肪酸分析反映微生物群体的多样性，可以用来测定微生物量中真菌和细菌比例,在生物体中的浓度恒定：不随种类、生长条件和生理状态而变化,微生物PLFAs 组成随环境及生理状态而有所变化,膜磷脂脂肪酸总量与土壤微生物量(SIR
3、法)的相关性,(Bth&Anderson,2003),真菌膜磷脂脂肪酸特异性,土壤中麦角甾醇(真菌组成指示物质)和18:2w6,9 PLFA含量之间的相关性(Bth&Anderson,2003),提取测定土壤脂肪酸基本步骤,土壤样本脂肪提取 氯仿:甲醇:缓冲溶液=1:2:0.8(体积比),脂肪组分分离 通过硅酸柱将脂肪分为中性脂肪、糖脂和极性的磷脂3个组分,根据脂肪酸的饱和度、羧基数目及几何特性等，区分不同种类的磷脂脂肪酸,气相色谱分析磷脂脂肪酸量,生物多样性指标,丰度 生态系统中物种总数；Species EvennessDiversity index Shannon 指标Simpson 指标
4、Berger-Parker指标Alpha指标,膜磷脂脂肪酸分析应用实例-土壤微生物中真菌细菌比例随土壤pH变化,真菌细菌生物量系数 用18:2w6,9 PLFA 和13种细菌特有的PLFA 分别作为真菌和细菌的指示物(Bth&Anderson,2003),定量描述微生物群落结构和生物多样性；敏感地反映微生物群落结构变化较为简单、有效微生物的PLFAs 组成随环境及生理状态而有所变化 大多数微生物细胞膜上占优势的脂肪酸组成很相 似，PLFAs分析不能鉴定微生物种类；是较为粗略的反映微生物群落结构和功能多样性的参数，不能指示群落中单个菌种的变化,PLFAs方法评价,膜磷脂脂肪酸分析（Phospho
5、lipid Fatty AcidsPLFAs）代谢指纹技术(Biolog)Metabolic fingerprinting techniques-Community level physiological profiles(CLPPs）,微生物群落结构分析方法,根据微生物利用碳源特性，选择含有不同碳源物质的微平板将土壤悬液接种于GN、GP、Ecoplate 微平板中，微平板中氧化还原染料形成的颜色能指示微生物对不同碳源的利用程度Ecoplate平板：96孔微平板中含有3个重复的31种碳源,BIOLOG 分析代谢指纹技术-群落水平生理特征图,微生物利用不同的碳源物质，产生电子传递体烟酰胺腺嘌呤二
6、核苷酸(NADH)；四氮唑接受电子，转变为紫色的甲僭(音同建）；颜色的深浅及形成速度，反映不同类型微生物的数量及活性,Biolog 测定原理,BIOLOGEcoPlateTM,EcoPlate碳源基质类型,10 g土壤90 ml无菌水,4振荡1 h（200 rpm/min）,取上清液用无菌水做成10-3的土壤稀释液,吸取150 l 接种至ECO板的微孔中,在Emax自动读盘机上 每24 h 读取一次590 nm 处光密度值，直至不再变化。,25 下培养72h,BIOLOG 测定步骤,采用孔平均染色程度法(Average Well Color Development,AWCD)或曲线积分法(CI
7、)，得出终点数据的标准转换值，AWCD或CI。AWCD=(C-R)/n C：每一个微孔的光密度值R：空白微孔的光密度值n：碳源底物的数目(ECO板 n=31)根据培养时间计算每一个样品的总平均AWCD值；应用主成分分析(PCA)比较不同的样本,数据分析,箭头所指的是土壤化学和物理性状BD:容重;DP:入渗空隙;EC:电导率;AWC:有效水容量;N:氮;OMC:有机质含量；SP：饱和率;PW:孔隙水,土壤微生物群落结构以及物理化学性状受污水灌溉的影响,Waste water treated control,主成份分析 土壤加入不同浓度的Hg培养一周后，在 31种单独碳源基质上最大显色速率;主成份
8、1和2分别解释总变异的 41.1%和17.4。(Mller et al.,2001.FEMS Microbiology Letters,204,49-53),应用实例-微生物群落对土壤中Hg响应,主成份1,主成份2,优点简单、快速，适用于大量样品的测定尤其适合对于根际微生物群落结构的分析局限性 只适用于可培养的微生物 选择性测定能利用简单基质快速生长的微生物不适于森林土壤 常用的Ecoplate平板中碳源物质缺乏纤维素、半纤维素、木质素、几丁质等森林土壤中常见的有机物质,Biolog 方法评价,基于16S rDNA 分析方法描述群落结构,基于PCR 16S rRNA分析,利用荧光染色显微镜镜检
9、发现每克土壤或水体沉积物可含有1010 个细菌 而利用琼脂板分离到的细菌在森林土壤中仅占0.1-1%，在农田土壤中也不过10%；利用分子生物学技术可以分析包括不可培养的微生物在内的整个土壤微生物群落结构；,rDNA扩增及限制性位点分析(ARDRA),Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis 通过PCR扩增、克隆可探测到已知和未知的DNA序列，但每克土中有4000多种微生物，分析每个土壤样本要测序几千个序列，非常耗时，利用ARDRA提取土样中DNA;利用一定的标记引物(如荧光)对样品中的DNA进行特异扩增；然后进行限制性内切酶酶解,获得末端限制性片
10、段TRFs；电泳分离片段，检验TRFs的多样性；利用主成份分析比较不同样本的末端限制性片段的特征,多聚酶链反应-变性或温度梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE/TGGE),Denaturing/Temperature Gradient Gel Electrophoresis 使用1对特异性引物，利用PCR扩增微生物自然群体的16S/18S rRNA基因;产生长度相同但序列不同的DNA片段的混合物，然后用DGGE分离；所得环境样本的特异性DGGE条带，经切胶，再进行PCR扩增特异性DNA片段直接测序或经DNA克隆、测序；进行系统发育分析，构建遗传相似性图谱，以揭示微生物多样性演变的内在机制,CsC
11、l/ethidium bromide 密度梯度平衡离心法分离同位素标记的DNAa:从利用 12C-或 13C-methanol 作惟一碳源纯培养的M.extorquens AM155 提取的DNA；b,c:分离前后从加入12C-or 13C-methanol作惟一碳源的土壤中提取出的DNA Bar:1cm(Radajewski et al.,2000 Nature 403,646-649),稳定同位素探针技术,从一系列单个基因组序列分析推断它们在环境中相互作用,Kowalchuk,2005,测定特定环境基因组序列,并利用技术和试验设计降低复杂程度,生物多样性指标,Alpha(a)多样性 特定区
12、域、群落或生态系统中生物多样性，一般用物种丰富度表示；Shannon 指数 H=-SPilnPi(i=1 to S)S:物种数；Pi=ni/N:第i个物种个体(ni)占全部个体N比例。是communication entropySimpson 指数 D=1-SPi2(i=1 to S)Pi2=ni(ni-1)/N(N-1);0D 1,接近1说明生物多样性高，或环境空间异质性大，而近于0说明多样性小,Beta-diversity=(S1c)+(S2c)S1,S2分别是两个群落的物种数；c 在两个群落中都有的物种数，可用来比较生态系统或表征环境梯度的影响；Srensens similarity i
13、ndex b=2c/(S1+S2),参考文献,1)Firestone M.,Balser T.,Herman D.Defining soil quality in terms of microbial community structure.Annual Reports of Research Projects,UC Berkeley,1997 2)Garland J L.,Mills A L.Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns o
14、f community level sole carbon source utilization.Appl.Environment Microbiology,1991,57:2351-2359 3)Garland J L.Analytical approaches to the characterization of samples of microbial communities patterns of potential C source utilization.soil biology biochemistry,1996,28:21322 4)Muller A.K.,Rasmussen L.D.,Srensen S.J.Adaptation of the bacterial community to mercury contamination.FEMS Microbiology Letters 2001,204:49-53 5)Zelles L.Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in thecharacterisation of microbial communities in soil:a review.Biol Fertil Soils 1999,29:111129,
