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1、常用实验基本技术（续）,四大常用基本技术,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）免疫组织化学技术（免疫组化）免疫印迹技术（Western blot）细胞培养技术,局限性 联合应用,细胞培养技术,细胞培养（Cell culture）是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。细胞培养便于应用各种方法和技术进行研究，并可直接观察，已成为现代生物医学研究中一项非常重要的技术。,培养细胞的生存条件,无菌环境（器皿、超净台）超纯水温度（37左右）气体（5%CO2/空气）PH值（7.0-7.4，细胞耐酸不耐碱）营养条件（基础培养基+10%FBS）渗透压、
2、培养基质等,细胞培养用液,平衡盐溶液：洗涤组织、细胞 D-Hanks液、PBS液等。消化液：分散细胞 0.25%胰酶、0.02%EDTA液或二者混合使用培养液：细胞生存、生长和繁殖 基础培养基(DMEM、RPMI1640等），已商品化 10%左右的胎牛血清（FBS）,培养细胞的来源,直接取材：实验动物、胚胎、临床标本等细胞系：各实验室保存 细胞库：上海中科院细胞库、武汉细胞库、中国医科院细胞中心,培养方式,原代培养：直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。只能原代培养：神经元、心肌细胞等。传代培养：当培养细胞增殖到一定密度后，生长受到抑制，需要分散稀释后重新培养。常见：肿瘤细胞系,培养细胞的
3、处理,改变细胞外部因素改变细胞内部因素,外部因素,药物高温低氧射线,内部因素,改变细胞内基因表达水平：上调：基因转染 下调：RNAi,细胞转染,转染（transfection）是指将外源性DNA或 RNA导入细胞的过程。上调目的基因表达：质粒载体 病毒载体下调目的基因表达：化学合成siRNA 质粒载体 病毒载体,转染方法,电转法脂质体介导的转染法病毒载体介导的转染法,转染试剂,脂质体与非脂质体：商品化，多家公司如Invitrogen、Fermentas、Qiagen等都有售。常用：Invitrogen公司Lipofectamine 2000 可用来转染质粒和siRNA.其他专用试剂：如Invi
4、trogen公司RNAiMAX Transfection Reagent 专门用来转染siRNA.,瞬时转染与稳定转染,瞬时转染：将DNA导入活细胞内，但DNA不会嵌入细胞的染色体中，可在2-3天内收集被转染的细胞进行基因表达分析。稳定转染：将目的基因导入活细胞，根据选择标记经过一段时间的筛选，使目的基因整合入细胞染色体中，从而得到稳定表达目的基因的细胞系。,真核筛选标记,设立对照组,空载体对照：如PCDNA3、PEGFP-N1等。Scrambled siRNA：将选中的siRNA序列打乱。作为阴性对照的scrambled siRNA应该与选中的siRNA序列有相同的核苷酸组成，并且与目的基因
5、的mRNA没有明显的同源性。,细胞特性检测,活力：MTT实验凋亡：TUNEL染色、流式细胞术等增殖：BrdU掺入法、克隆形成实验分化：形态学观察、分化标志物检测致瘤性：体内成瘤实验,靶基因表达水平检测,RT-PCRWestern blot免疫组化其他：基因芯片、流式细胞术等,细胞培养的应用,用途：1.验证体内实验结果 2.进行深入机制研究优点：可同时获得大量生物学性质相似的细胞作为研究对象，便于施加各种干预因素，方便观察与检测。局限性：不能准确反应体内的真实状况，需与体内实验相互验证。,神经干细胞分离培养,取E12.5d小鼠胚胎端脑，制成单细胞悬液，接种于神经干细胞培养基，体外培养2天，可见神
6、经球形成。,NSC鉴定,体外培养神经干细胞BrdU(+)，Nestin(+)，并能分化为MAP2(+)神经元和GFAP(+)星形胶质细胞。,出生后7天小鼠脑切片，可见G-CSFR与Nestin共表达。SVZ：室管膜下区；LV：侧脑室,体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：Nestin（神经干细胞marker）与G-CSFR共表达于神经干细胞。RT-PCR结果也显示神经干细胞表达G-CSFR。,体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：与对照组相比，G-CSF作用组BrdU阳性细胞比例明显增高。,小鼠脑切片，免疫染色结果显示，与对照组（CT）及缺血缺氧性模型组（HI）相比，G-CSF处理组（HI+G-CSF）室管膜下区（SVZ）BrdU阳性细胞数明显增加。,谢谢！,
