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1、第七章 放射免疫分析试剂盒的制备,一、概要二、放射免疫分析试剂盒主要组分的制备技术三、典型放射免疫分析试剂盒的制备四、免疫分析技术进展,一、概要,放射免疫分析技术（RIA）是基于免疫分析的特异性与放射性测量的高灵敏性而建立的一种超微量分析方法，能够定量检测生物体内成百上千种活性物质，是现代生物、医学和临床诊断的重要手段。,1 概念与原理,以放射性核素（主要为125I,57Co,3H,14C等）标记抗原，抗体，配基或受体，在体外条件下，经过不同的结合反应（竞争或非竞争性的），再将结合和未结合的标记物分开，测量其放射性活度，从而计算各种生物活性物质的含量。,基本原理,抗原(Antigen)：能刺激
2、动物机体的免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内外与其发生特异性反应（结合）的物质。一般为异种或异体物质（即机体的免疫活性细胞从未接触过的异物）。完全抗原：具有上述两种特性，即单独能刺激动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，又能与这些产物在体内外发生特异性结合生成抗原-抗体复合物。大多为大分子量的蛋白质。半抗原(Half Antigen,Hapten)：单独不能刺激动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，但能与相应的抗体或致敏淋巴细胞起特异性结合反应生成抗原-抗体复合物的物质。与载体结合后注入动物体内能诱导抗体形成，即成为完全抗原。,抗体(Antibody)：由抗原诱导形成的一种血清球蛋白，与抗原结合
3、形成抗原-抗体复合物。,特异性(Specificity)：抗体抗原反应具有特异性，即一种抗体（抗原）只能与相应的抗原（抗体）结合，不能与其它无关的抗原（抗体）结合。,主要的放射免疫分析方法,放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay,IRMA）受体放射性配体结合分析（Receptor Radio-ligand Bonding Assay,PRLBA）放射受体分析（Radio-Receptor Assay,RRA）,2 主要的放射标记免疫分析方法,1958-1960年由Yalow RS and Breson SA创建，
4、为最早的放射标记免疫分析方法。（1977年获得了诺贝尔生物医学奖）。原理：用放射性核素标记抗原，标记抗原与非标记抗原同时竞争结合物（如抗体）上有限的结合位点。然后将结合与未结合的游离抗原分离，测定其放射性分布，利用标准曲线确定样本中待测物的含量。,1)放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）,Ag*+Ag+Ab Ag*-Ab+Ag-Ab,游离物（F）复合物（B）,对于RIA，应满足以下条件：,抗原是纯一的，只由一种化学成分组成；抗体也仅由一种化学成分组成；抗原与抗体均为单价，即一分子抗原只能和一分子抗体反应；标记的和未标记的抗原具有相同的物理-化学性质；抗原-抗体反应遵循质量作
5、用定律；反应达到平衡；结合抗原和未结合的游离抗原能完全分开，且不破坏反应平衡；能准确测量结合抗原和游离抗原之比，或结合抗原与总抗原之比。,K1,Ag+Ab AgAb k-1,K（亲和常数）=(AgAb）/Ag Ab k-1,b/f=（AgAb）/(Ag)=K(Ab)b/f=K(AbT-B),K1,放射免疫分析的Scatchard图,2)免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay,IRMA）,在RIA基础上建立起来的标记免疫分析方法。原理：用放射性核素标记抗体，以过量的标记抗体与抗原结合建立的方法.,免疫放射量度分析原理示意图,IRMA剂量反映曲线,RIA反映曲线,RIA与
6、IRMA反应式比较,RIA与IRMA的工作原理主要区别,3 放射标记免疫分析方法的特点,二、放射标记免疫试剂盒主要组分的制备技术,（一）标记物的制备技术,可用于放射免疫分析的放射性核素,Bolton-Hunter（BH）方法 其它间接标记法,1 125I的标记,2 标记物的分离纯化,3 标记物的质量鉴定,4 标记物的稳定性及贮存条件,多肽类标记物通常采用冷冻干燥方法贮存;小分子化合物及单抗标记物可以液体状态贮存;标记物通常在2-8条件下保存，有效期约周。,（二）抗原和抗体的制备技术,免疫原（抗原）的制备,免疫原的制备,采用生化技术提取(人体器官或体液）采用偶联技术制备,2 抗体制备,动物种属选
7、择,免疫增强剂,凡可增强被免疫动物免疫应答反应的物质均可称为免疫增强剂，其种类众多。,免疫,抗血清的质量鉴定,抗体贮存,抗血清加入0.1%-0.2%防腐剂，按需要量分装、冻干，-50贮存。,（三）单克隆抗体的制备,1975年由Kohler和Milsten采用杂交瘤技术第一次获得。基本原理：利用动物脾细胞即淋巴细胞可以分泌特异抗体，而骨髓瘤能够在体外连续培养的性质，将两种细胞在融合剂（通常为PEG）的作用下进行融合，获得既可分泌特异抗体又可在体外连续进行培养的杂交瘤细胞。因此，这种杂交瘤细胞就能在细胞培养中产生大量单一类型的高纯度抗体。,单克隆抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆
8、抗体/多株抗体由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。,制备过程,与多克隆抗体比较,（四）分离剂,分离剂的作用是将分析体系中游离部分与结合部分进行有效的分离，直接影响RIA测量结果的准确性。,（五）标准品与参考血清的制备,1 标准品,2 参考血清,一般含一个或几个分析物，是免疫分析中用来比较和评价不同测定系统的偏倚和重复性的血清，也是用于内部或外部质量评价的主要试剂。,（六）数据处理与分析方法的有效性评估,三、几种典型放射免疫分析试剂盒的制备,（一）甲状腺素放射免疫分析试剂盒的制备,（二）游离甲状腺素FT4试剂盒的制备,（三）人血清促甲状腺激素免疫放射分析试剂盒的制备,四、免疫分析技术进展,国际市
9、场市场规模接近300亿美元，近期每年增长率在7-9%左右。,特点 检测品种多，达近千种，并且还在持续增加；同一公司有多个产品技术平台；多种免疫分析方法并存，相互竞争，相互补充；大公司产品系列全，小公司产品有特色；高度集成、自动化的仪器诊断与简单、快速便于普及的快速诊断。,国 内 200余厂家；北京北方生物技术研究所 潍坊三维生物工程集团有限公司 北京科美东雅生物技术有限公司 原子高科股份有限公司 100余种系列产品；市场规模40亿元（国内与国外各占一半）；年增长率10-16%；,面临的挑战,酶免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved Fluoroimmunoassay,TRF)化学发光免疫分析(Chemiluminesent immunoassay,CLIA）,放射免疫分析和非放射免疫分析技术性能比较,传统的RIA使用市场可能会逐渐缩小！,预计在未来十年中，体外诊断技术将会快速发展，并出现放免、酶免、化学发光、时间分辨荧光以及金标试纸条、生物芯片等多种体外诊断试剂优势互补，各自在不同领域广泛应用共存，国内和国外厂家纷争的竞争局面。,
