《基因载体的选择与构建课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因载体的选择与构建课件.ppt（59页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第三章,基因载体的选择与构建,一、载体的功能、特征及质粒载体,克隆载体（,clony vector,）,：具有在细胞内进行,自我复制的,DNA,分子，起运送目的基因到受体,细胞的作用。,目前基因工程中常用的载体有：,细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、,病毒载体、人工染色体等。,一）载体的功能,1.,运送外源基因高效转入受体细胞,2.,为外源基因提供复制能力或整合能力,3.,为外源基因的扩增或表达提供条件,二）载体应具备的特征条件,1.,能在宿主细胞内,独立和稳定的自我复制,2.,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或,整合位点,3.,长度尽可能小，以提高其载装能力,4.,具有,多种单一的酶切位点,
2、5.,具有合适的,选择性标记,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,三）质,粒,（,plasmid,）,质粒,是存在于细菌细胞质中独立于染色体,而自主复制的,共价、封闭、环状双链,DNA,分子,（,Covalently closed Circular DNA,ccc DNA,）。,不是细菌生长所必需的,可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力,分子量在,1-200kb,之间,1,、质粒的基本特性,（,1,）自主复制性,携带有自己的复制起始区（,ori,）,控制质粒拷贝数的基因,能独立于宿主细胞的染色体,DNA,而自主复制,（,2,）不相容性,同一复制系统
3、的不同质粒在同一细菌中,不能相容,不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存,（,3,）可扩增性,质粒就其复制方式而言分为两类,松弛型复制,严谨型复制,（,4,）可转移性,在天然条件下，大多质粒可通过,细菌接合作用从一种宿主细胞内转移,到另外一种宿主内。,2,、质粒的构建,（,1,）,天然存在的两种质粒,A,、,colE1,宿主细菌大肠杆菌,6.5kb,松弛型,复制,20-30/cell,B,、,pSC101,宿主细菌沙门氏菌,8.8kb,严谨型,复,制,5copy/cell,（,2,）,质粒人工构建的目的,天然质粒存在缺陷,不适合用作基因工程的载体,必须对之进行改造构建,方法,:,重组,，“,拼拼
4、接接，挖肉补疮,”,（,a,）,加入合适的选择标记基因,（,b,）,增加或减少合适的酶切位点,（,c,）,缩短长度,，,增加装载量,（,d,）,改变复制子,，变严紧为松弛，变少拷,贝为多拷贝,（,e,）根据基因工程的特殊要求,加装特殊的基,因元件,pBR322,为,4.36kb,的环状双链,DNA,。,例如：,pBR322,普通型载体,pBR322,的结构图,pBR322,BamHI,SalI,HindIII,PstI,ScaI,Amp,r,ori,(4.36 kb),利,用,抗,性,基,因,进,行,重,组,子,的,筛,选,重组DNA,Amp,r,Tc,s,提取DNA,电泳,Amp,r,Amp
5、,r,Amp,r,Amp,r,Tc,r,Tc,r,Tc,Amp,r,Tc,s,Tc,s,转化,无菌落,阳性菌落,筛选重组子,2)DNA重组,无DNA插入,有DNA插入,外源DNA,1)限制酶切,3,、质粒的制备,实验室一般使用两种方法制备质粒,（,1,）,碱裂解法,（,2,）,沸水浴法,（,1,）碱裂解法,原理：利用溶菌酶在,NaOH,与,SDS,的混合溶液中破坏,细菌外壁，去除染色体,DNA,及变性蛋白质，,离心，苯,酚氯仿溶液处理，乙醇或异丙醇沉淀水相质粒。,特点：,质粒较纯，收得率高，繁琐，且,有开环现象,（,2,）,沸水浴法,特点：,质粒不纯，收得率低，且制备规模小，,但快速，特别适用
6、于重组质粒的鉴定,。,1),用限制性内切酶消化,DNA,样品,2),用限制性内切酶消化,质粒,DNA,3),连接样品,DNA,和质粒,DNA,的消化产物,4),用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,5),涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选,4,、典型的质粒克隆技术,1,）,用,限制性酶消化,DNA,样品,粘性末端,2,）,用,限,制,性,内,切,酶,消,化,质,粒,DNA,3,）,连接样品,DNA,和质粒,DNA,的消,化产物,冷循环器,4,）,用连接产物转化,大肠杆菌,感,受态细胞,转化细菌有两个基本方法。,一是,化学法，即用,CaCl,2,处理并加热激以,促进,DNA,进入菌体；,二是电激法，即
7、,施加短脉冲的电荷以促进,DNA,吸收。,5,）,细菌在加有,Amp+X-Gal,的培养,基上生长以进行筛选,筛选会有三种结果：,一是要,插入的序列自连,，结果,没有,菌落形成,；,二是,切开的质粒重连,，结果表现为,蓝色菌落,；,三是要,插入的序列与质粒相连,，产,生,白色的抗氨苄青霉素菌落,。,倒平板,Amp+,X-Gal+IPTG,培养基的筛选菌落法,加,IPTG,和,X-GAL,乳糖和诱导物,IPTG,的化学结构,i,so,p,ropyl-beta-D-,t,hio,g,alactopyranoside,X-gal,X-gal,水解,筛选结果,?,蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表,达出由
8、完好的,LacZ,序列编码的,功能,性的,片段,?,白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉,素菌，质粒上,LacZ,序列,上有,插入片,段,筛选结果模式图,蓝,菌,落,蓝白菌落,筛选白色菌落,二、噬菌体载体与黏粒载体,一）噬菌体载体,噬菌体是大,肠杆菌的噬菌体，,它由外壳蛋白和,-DNA,组成,噬菌体,(,电镜图）,1,、,-DNA,的物理图谱,-DNA,为,线状双链,DNA,分子,，两端各有一个,12,核苷,酸的互补单链（粘性末端）,GGGCGGCGAC CT,CCCGCCGCTGGA,，称为,cos,区,，全长,48.5kb,。,特点是功能相近的基因在基,因组中聚集在一起。,cos,位,点,的,作
9、,用,2,、感染周期,噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细,胞，将其,DNA,导入,：,（,1,）,吸附,（,2,）,DNA,注入,（,3,）,DNA,复制,（,4,）,包装,:,只能包装,-DNA,分子的,75%-105%,即包装范围为,36.4kb-50.9kb,的,DNA,（,5,）,裂解,吸附,穿入,生物合成,成熟、释放,毒性噬菌体的溶菌性周期,温和噬菌体的溶菌性周期,温和噬菌体的溶源性周期,前噬菌体,噬菌体线性双链,DNA,病毒，具有末端互补的,12nt,，,感染细菌后粘端互补成双链环状。全长,48 531bp,，含,50,多个基因。,二）,DNA,载体的构建,建立,克隆载体前需要解
10、决两个问题：,1,）,DNA,分子只能增加,5%,的大小，即只能插,入,3kb,的,DNA,分子。,2,）,基因组非常大，对于每一种酶来讲都含,有超过,1,个的识别序列，酶切后产生多个片段，,连接不能形成,基因组。,.,缩短长度,缩短多余片段提高装载量。,（,a,）,插入型载体,（,b,）,取代型载体,.,修饰酶切识别位点,多余的酶切位点必须被修饰,自然选择法,通过自然选择法筛选无,EcorI,识别位点的,-,噬菌体,三）,-DNA,的抽提,1),大肠杆菌培养至对数生长期,2),加入,-,噬菌体或重组,-,噬菌体悬浮液，,37,培养,1hr,3),用新鲜培养稀释，继续培养,4-12hr,4),
11、高速离心，沉淀噬菌体,5),苯酚抽提，释放,-DNA,6),乙醇或异丙醇沉淀,DNA,四）,-DNA,作为载体的优点,1),体外包装病毒颗粒，高效感染,E.,coli,2),装载外源能力为,25kb,，大于质粒,3),筛选方便,4),重组,-DNA,分子提取容易,五）,cos,质粒,（,cosmid,）,1,、,cos,质粒的构建,cos,质粒,含有,-DNA,两端,cos,区的质粒,能容纳大片段（,45kb,）的小分子（,4kb,6kb,）载体,组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连,接入的,cos,位点,Cos,质粒,pJB8,2,、,DNA,的体外包装,3,、,考斯质粒的优越性,1),体外包装，高效导入受体细胞,2),装载比质粒或,-DNA,大得多的外源片段,3),携带质粒的选择标记，便于筛选,4),多种单一酶切位点，便于克隆,Thank You!,
