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1、教师：王华单位：吉 林 大 学 基础医学院 分子生物学教研室,电话：85619369(L)E-mail:,Strategies for analyzing gene function,基因功能的鉴定技术之二,在mRNA水平上,RNA干涉,反义RNA,在基因水平上,基因敲除技术,转基因技术,在蛋白质水平上,酵母双杂交技术,基因功能的研究是21世纪生命科学研究的重点之一，希望能发现更多的功能基因造福于人类。,基因功能的鉴定技术之二,反义RNA（anti-sense RNA）,能与mRNA互补的RNA链,称作反义 RNA.,反义技术的应用实例：用 BCL-2 Anti-sense oligonucl
2、eotide,通过与细胞内特定mRNA互补，封闭特定基因的表达，达到治疗疾病的目的。治疗 B淋巴瘤 和 白血病。,BCL-2癌基因,第三节 通过封闭mRNA，而使基因功能失活,美国科学家安德鲁法尔(左)和克雷格梅洛(右)：发现了干扰机制。,2006年,Andrew Z.FireStanford University School of Medicine,Craig C.MelloUniversity of Massachusetts Medical School,第四节 RNA干涉（RNA interference,RNAi）,问:你知道最早发现RNAi现象是在什么情况下吗？,1995年，康奈
3、尔大学Su Gou博士的实验：用反义RNA(anti-sense RNA)转染线虫可以阻断par-1基因的表达；在正义RNA(sense RNA)的对照组中也出现了基因受抑现象。,Larva:幼虫Moult:脱毛,线虫的优点：1.可用大肠杆菌饲喂2.about 1000 cells,3.基因组小(100 Mbp)4.在生活史的各阶段皆透明 5.3.5天一代.,Hatch:孵化,提示:一些实验现象可能是当时知识背景下所不能认识的，但客观地呈现这些实验现象是非常重要的。,许多科学的重大发现都源于意外的实验现象诸如：RNAi现象青霉素霉菌，抑菌环葡萄酒葡萄变“坏”伟哥心肠变硬的药，提高性欲，治疗冠心
4、病纯化抗体杂蛋白吸附到介质上（pH值的变化）,Why？,该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。,一、RNAi的历史,（1）用纯化后的单链RNA注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的！（2）将双链RNA给线虫注射，出现了高效、特异性的基因抑制效应。（3）Su Guo博士在转染正义 RNA时污染了微量反义RNA，“十分错误”地将双链RNA(dsRNA)导入了细胞。,1998年:Fire和Mello的实验揭开这个悬疑之谜：,他们将这种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象，称作RNA干涉（RNAi）。,Fire,A.et al.Potent and specific genetic interferen
5、ce by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature 391,806-811.(1998),进一步的研究发现：（1）RNAi的活性可以远程表现（2）RNAi的作用可传给后代,在C.elegans应用双链RNA的途径：,（1）直接注射到肠道（2）饲喂（3）浸泡,例如：GFP 转基因植物的叶子:从叶片的一端注射GFP siRNA,可干扰整个叶片 GFP 的表达。,RNAi广泛存在于自然界,想想：由于antisense-RNA的原因,在细胞内出现dsRNA正常吗？细胞内是否存在特异性降解dsRNA的机制？,Dicer负责识别并切割dsR
6、NA,RNase 家族中成员识别、降解双链RNA产生约2123nt bp片段每个片段3端有2个碱基突出,二、RNA 干涉（RNAi）的机理,活化阶段：siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC中的解旋酶将其中的siRNA变成单链,成为activated RISC。,Long double-stranded RNAs(dsRNAs;typically 200 nt)can be used to silence the expression of target genes in a va
7、riety of organisms and cell types(e.g.,worms,fruit flies,and plants).Upon introduction,the long dsRNAs enter a cellular pathway that is commonly referred to as the RNA interference(RNAi)pathway.First,the dsRNAs get processed into 20-25 nucleotide(nt)small interfering RNAs(siRNAs)by an RNase III-like
8、 enzyme called Dicer(initiation step).Then,the siRNAs assemble into endoribonuclease-containing complexes known as RNA-induced silencing complexes(RISCs),unwinding in the process.The siRNA strands subsequently guide the RISCs to complementary RNA molecules,where they cleave and destroy the cognate R
9、NA(effecter step).Cleavage of cognate RNA takes place near the middle of the region bound by the siRNA strand.In mammalian cells,introduction of long dsRNA(30nt)initiates a potent antiviral response,exemplified by nonspecific inhibition of protein synthesis and RNA degradation.The mammalian antivira
10、l response can be bypassed,however,by the introduction or expression of siRNAs.,效应阶段：Activated RISC与靶mRNA结合，利用自身核酸内切酶活性在距离siRNA 3端12个碱基的位置将mRNA切断、降解靶mRNA。,起始阶段：异常dsRNA 被细胞内的Dicer酶特异识别、切割成长2123nt的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA,siRNA）。,siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA；,RISC中的siRNA与靶RNA结合时还可作为引物，并在RNA聚
11、合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，合成更多新的dsRNA；新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。,二、RNA 干涉（RNAi）的机理*,RNA干扰过程主要有3个步骤：,三、RNAi技术,利用短双链RNA(siRNA)能启动 特定 mRNA降解的特性，将人工设计的 siRNA 导入靶细胞中，启动RNAi，从而诱导特定mRNA降解，抑制特定基因表达的技术。,*,确定目的基因,设计 SiRNA 序列,化学合成或体外转录,在体外，获得 SiRNA,构建SiRNA表达载体,转
12、染细胞,转染细胞,细胞内表达 SiRNA,RNAi 效果检测,如何开展RNAi 实验？,构建SiRNA表达载体,在细胞内转录,RNA pol 启动子(U6)可以在哺乳动物细胞中表达小分子RNA。,了解,UU,Dicer RNase III,A.Transfection,B,C,Targeting,mRNA cleavagesuppression,SiRNA,如何开展RNAi 实验？,四、SiRNA的设计原则：,随机选取不考虑位点信息脱靶效应严重,NCBI 软件生物信息分析具有最小脱靶效应的功能性siRNA,避开起始100bpAA（N19）TT GC含量BLAST检索.大量筛选,了解,五、RNA
13、i技术的应用,1)研究基因的功能,用 RNAi 来抑制癌基因的表达，进而抑制肿瘤的生长。,肿瘤细胞,2)封闭有害基因的表达：抗肿瘤、抗病毒,缩短人类对基因功能的认识时间,CD4 siRNA 封闭受体，使HIV不易进入宿主细胞。p24 siRNA 抑制HIV蛋白质的合成和HIV的复制。,六、RNAi 技术优点,RNAi(knockdown)VS 同源重组(knockout)高效率易于操纵可实现多种基因突变,RNA干扰(RNA interference,RNAi)*是由短双链RNA（double-stranded RNA，SiRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。其抑制基因表达的效率比
14、反义RNA至少高2个数量级。,siRNA是可以反复利用的!,通过封闭mRNA反推基因的功能,Summary:,Post-transcriptional gene silencing，PTGS,相关技术：Anti-sense RNARNAi,橙色：解旋酶绿色：内切酶,由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗。,基因功能研究的策略,在mRNA水平上,RNA干涉,反义RNA,在基因水平上,基因敲除技术,转基因技术,在蛋白质水平上,酵母双杂交技术,基因功能的研究是21世纪生命科学研究的重点之一，希望能发现更多的功能基因造福于人类。,第五
15、节 酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）,转录激活因子（TAF=BD+AD）,Activation domain,BD,(AD),DNA binding domain(BD),回忆：转录激活因子的结构特征,AD的作用：促进基因转录,两个结构域是转录激活因子发挥活性所必需的，缺一不可。,一、原理,1.两个结构域分别与两个蛋白融合，各自均没有转录激活因子的活性,第五节 酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）,一、原理,2.BD和AD空间位置靠近，可以恢复TAF的作用：,BD-融合蛋白(诱饵)AD-融合蛋白(待测),两个蛋白相互作用使BD和AD空间位置靠近,一、原理,酵母双杂交（Y
16、east-Two-Hybrid）,在真核模式生物酵母中，利用蛋白质-蛋白质相互作用来激活报告基因的转录激活因子，并以报告基因表达产物作为检测信号来检测蛋白质间是否发生了相互作用的技术方法。,体内(活细胞内)检测；敏感方法。,二、酵母双杂交实验是如何进行的：,BD,MCS,P,BD vector,Transformation,Transformation,1、构建两种酵母表达载体,AD,MCS,P,AD vector,已知基因：bait,cDNA文库基因：Fish,express GAL4-BD-已知蛋白.,selected on Trp deficient media.,色氨酸,express
17、 GAL4-AD-Fish protein.,selected on Leu deficient media.,Leucine,Mating plating,Transformation,Transformation,交配,2、将两种载体放到一个酵母细胞中,selected on Trp deficient media.,selected on Leu deficient media.,只有共转化成功的酵母菌才能在Trp&Leu deficient 的培养基上生长！,BD,MCS,P,BD vector,AD,MCS,P,AD vector,已知基因：bait,未知基因：Fish,expres
18、s GAL4-BD-已知蛋白.,express GAL4-AD-Fish protein.,3、筛选发生了蛋白质-蛋白质相互作用的酵母株,报告基因-Lac Z 基因和His基因的转录激活因子都是GAL4，即启动子上都有GAL4 的binding site。但启动子序列除了GAL4 binding site 相同外，其余序列完全不同。,Histidine,Only yeast cells expressing interacting protein survive.,LacZ 表达产物检测：使底物X-GAL显蓝色营养代谢有关基因表达产物检测：HIS基因的表达可以使酵母细胞在相应的营养物质缺乏的平
19、板上生长,lacZ,GAL4-binding site,His3,Promoter,Reportor Gene,酵母菌株Auxotrophic具有报告基因：LacZ 和 His。,4、分析 Fish,对AD-fish质粒进行DNA测序、在cDNA数据库中进行同源性比较分析，确定fish确定这些发生了相互作用的蛋白质中，哪些是目前未知的fish！,酵母双杂交技术的基本过程,fish,三、酵母双杂交系统的应用,1、筛选与已知蛋白质相互作用的未知蛋白，并确定其编码基因2、检测已知蛋白质间的相互作用的结构域及氨基酸序列通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功
20、能域或关键氨基酸。,拓展知识,是细胞内的一类非编码小分子RNA(22nt),细胞内有microRNA(miRNA),miRNA gene-Pre-microRNA(具有颈环结构的ssRNA，约70nt）-运输到细胞质-被Dicer切割miRNA控制着几乎每一个人类基因的活动。,拓展知识1,miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工,都是由双链RNA或RNA前体形成的。3.二者都是RISC组分，microRNA也可以引起mRNA降解。,micro-RNA的形成及作用机制,RNA干扰机制示意图,翻译抑制（不完全匹配）,剪切目的mRN
21、A（完全匹配）,1.根本区别是miRNA是内源的，调节基因表达,是生物所固有的；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。正常情况下只有在病毒或其它dsRNA诱导情况下才产生siRNA，作为miRNA的完善和补充。2.在作用位置上：miRNA主要作用于靶标基因3-UTR区，可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解;而siRNA可作用于mRNA的任何部位，只能导致靶标基因降解。,miRNA与siRNA的区别：,问：RNAi为什么可能存在在脱靶(off-targeting)效应？,拓展知识2,1.正义链与RISC结合,解决办法：链偏好性（Strand bias）,使RISC只结合SiRNA的反义链。,2.miRNA-like pathway：Off-target silencing via seed-region activity,难点：RNi的机理、酵母双杂交的基本程序,【重点内容】,二、机理*,一、定义*,三、生物学意义*,第三节 RNi,第四节 酵母双杂交,二、原理*,一、定义*,三、基本程序,【课后思考】,miRNA的检测在乳腺癌或胃肠癌的诊断或用药指导方面的应用。,
