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1、第一章 分光光度技术p1,分光光度法（Spectrophotometry）：它是根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异的吸收光谱，而建立起来的一种定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法（Absorption spectrometry）。它不需要我们把欲分析的样品从混合物中分离开来，即可利用样品特殊的吸收峰或特殊的显色反应，直接进行定性、定量的分析。,第一节 基本原理,一、光的基本知识 光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光的波动性的特征，可用下式表示：C 为波长，为频率，c为光速，等于299 7704kms。,第一节 基本原理,入射
2、光的强度为Io，通过厚度为L的溶液后，透射光的强度为It，称为透光度（transmittance），用T表示。lg 称为吸光度A(Aabsorbance A)，又称为消光度(degree of extinction E)或光密度(optical density D)。,图1-1 光吸收示意图,第一节 基本原理,二、朗伯一比尔(1ambertBeer)定律 AKLC 它表示溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。,第一节 基本原理,三、吸光系数 吸光系数的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。1.摩尔吸光系数:指1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm时，在某一特定波长下的吸光度，用或E
3、M表示。2.百分吸光系数 其意义指某物质的1%（W/V）浓度的溶液，在厚度为1cm时，在某一特定波长下的吸光度，用E1%来表示。两种吸光系数表示方式之间的关系是 E1%,第二节 分光光度计的基本类型和组件,一、分光光度计的基本类型1:单光束分光光度计 2:双光束分光光度计3:二极管距阵分光光度计 4:双波长分光光度计,第二节 分光光度计的基本类型和组件,一、光光度计的基本类型,图1-2 各种类型分光光度计的结构示意图A:单光束分光光度计 B:双光束分光光度计C:二极管距阵分光光度计 D:双波长分光光度计,第二节 分光光度计的基本类型和组件,二、分光光度计的基本组件（一）光源:常用的有白炽灯（钨
4、丝灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。（二）分光系统(单色器):有棱镜及光栅两种类型。（三）狭缝:一对隔板在光路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度,第二节 分光光度计的基本类型和组件,二、分光光度计的基本组件（四）比色杯:玻璃比色杯用于可见光区，紫外光区要用石英比色杯。标准光径为10mm，还有带有自动进样装置的流动池。（五）检测及显示系统:光电检测器有四种类型：光电池、光电管，光电二极管及光电二极管距阵。,第三节 分光光度技术的应用,一、定量分析 1标准曲线(工作曲线)法 2.对比法=，即Cx=Cs 3计算法 C=,第三节 分光光度技术的应用
5、,二、定性分析 用分光光度计绘制出样品的吸收光谱曲线。各种物质都有它自己一定的吸收光谱曲线，利用用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。一般情况，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知物质的结构，往往需要与红外、质谱等其它方法相配合。,第四节 测试条件的选择,一、测试波长的选择 一般都是选择吸收光谱图中最高峰的max作为测试波长。这不仅能获得高的灵敏度；而且由于在max附近吸光度随波长的变化较小，入射光波长的稍许偏移和非单色性引起的吸光度变化较小，从而对比耳定律的偏离较小,图1-4 测试波长的选择及影响,测试波长的选择及影响,第四节 测试条件的选择,二、测量狭缝的选择 测定狭缝越窄，单色光“越
6、纯”，分辨率越高，但入射光强度也随之变弱，仪器噪声增大，于测量不利。狭缝过宽，单色光的带宽加大，纯度降低，将导致测量灵敏度的下降和工作曲线线性关系的变差。狭缝的选择必须根据实际情况兼顾两方面的因素，选择一个适中的值。三、吸光度测量范围的控制 在T2065(A0.70.2)的范围内误差相对较小，当T36.8(A0.434)时，测量的误差最小。为避免较大误差的出现，在测量高浓度样品时必须将样品进行适当的稀释。,第四节 测试条件的选择,四、参比溶液的选择 常用的空白溶液有以下两种。1溶剂空白：当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液。2试剂空白 当显色前的样品
7、在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这种方式最为常用。,第五节 分光光度法的误差,一、物理性原因产生的误差 1.入射光的纯度 2.杂散光的干扰 3.适当的吸光度测定范围 二、化学性原因引起的误差 溶液的浓度、pH、溶剂、温度等对化学平衡所产生的影响。由于样品的离解、缔合、与溶剂间产生作用、形成络合物等原因，导致溶液的各组分间的比例发生变化。,第六节 常见的分光光度计,一、721型分光光度计 是一种采用棱镜为单色器、光电管为受光器、表头指示结果的常用的可见光分光光度计。其波长范围为360800nm，在410710nm之间的灵敏度较
8、好。,第六节 常见分光光度计,二、722S型分光光度计 这是一种数码显示的可见光分光光度计，采用衍射光栅作为单色器，卤素灯作光源，使用波长范围为3401000nm。除了可直接进行透光率T%和吸光度A的测定，还具有浓度因子设定和浓度直读的功能。,第六节 常见分光光度计,三、日本岛津1240紫外/可见分光光度计（带Sipper 160型自动流动池）这是一种微机控制、数码显示的紫外/可见光分光光度计，采用衍射光栅作为单色器，卤素灯和氘（D2）灯作光源，使用波长范围为1901100nm。除了可直接进行吸光度A的测定，还具有波长扫描和定量测定的功能。,第六节 常见分光光度计,四、日本岛津1601紫外/可
9、见分光光度计（带Sipper 160型自动流动池）这是一种微机控制、数码显示的紫外/可见光双光路分光光度计，采用衍射光栅作为单色器，卤素灯和氘（D2）灯作光源，使用波长范围为1901100nm。除了具有进行吸光度A的测定和定量测定的功能外，还具有较强的波长扫描功能。,第六节 常见分光光度计,四、日本日立U2000紫外/可见分光光度计 这是一种微机控制、数码显示的紫外/可见光双光路分光光度计，采用衍射光栅作为单色器，卤素灯和氘（D2）灯作光源，使用波长范围为1901100nm。除了具有进行吸光度A的测定和定量测定的功能外，还具有较强的波长扫描功能。,五、使用分光光度计的注意事项 1.分光光度计必
10、须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。2.开机预热15分钟，待仪器稳定以后再开始进行测定。每年需定期进行波长校准。3.必须保证测试样品为澄清的溶液，肉眼看不出来的轻微浊度也能引起读数的严重误差，必要时可通过离心来去除微粒。检测细菌培养液的光吸收时例外。4.从冰箱中取出的样品一定要恢复到室温后再进行检测，否则低温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起读数持续漂移上升。,5.比色杯盛液量以达到杯容积2/3左右为宜。比色杯的外表面，则必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净，然后才能把比色杯放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。6.不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光学面。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，也可用甲醇冲洗。洗涤后应把比色杯倒置晾干或用滤纸条将水吸去，再用擦镜纸轻轻揩干。7.一定要保证比色皿正确放入光路后再进行测量。8.一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.20.7的范围内进行测定。这样所测得的读数误差较小。如吸光度不在此范围内，可调节样品溶液浓度，适当稀释或加浓，使其在仪器准确度较高的范围内进行测定。,结 束,
