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1、,论知识和方法原理,临床症状,病理变化,触片染色镜检,培养特性,生化特性,血清学试验,初步诊断,动物回归试验,确诊,流行病学调查,细菌感染的诊断,病毒感染的诊断,电镜技术,血清学试验,分子生物学技术,病毒的分离鉴定,标本采集与送检,病毒的分离,动物接种,是最原始的病毒培养方法，根据病毒,种类不同，选择敏感动物及适宜接种,部位，如嗜,神经性病毒（狂犬病毒）,可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于,家兔角膜或皮内。,鸡胚培养,鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵,化,9-14,天的鸡胚，根据病毒种类不同，,将病毒标本接种于鸡胚的不同部位，,最常用的鸡胚接种部位有羊膜腔、,尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。,病毒的
2、分离,组织培养法或细胞培养法,是将离体活组织块或分散的组织细胞,加以培养的技术总称，为病毒分离鉴,定中的最常用的基本方法。,病毒的分离,形态学检查,电镜和免疫电镜检查,普通光学显微镜检查,有些病毒在宿主细胞内增殖后，在细胞,的一定部位,(,胞核、胞浆或两者兼有,),出,现一个或数个、圆形或椭圆形、嗜酸性,或嗜碱性的结构，即包涵体。包涵体对,病毒感染的诊断有一定价值。,病毒感染的血清学诊断,是用已知病毒抗原来检测病畜血清中,有无相应抗体，故须待病畜感染后体,内产生抗体时才能检出。,在采取临床标本及病人血清应注意病,程，必须采取患畜急性期血清与恢复,期血清,(,双份血清,),进行血清学试验。,若第
3、二次血清抗体滴度比第一次高出,4,倍以上时，才有诊断意义。,?,现代免疫的概念：,是机体识别“自身”与,“非己”抗原，对“非己”抗原产生排斥,作用，对自身抗原形成天然耐受的一种生,理功能。,免疫的定义,免疫的基本特性,1,识别自身和非自身,这是免疫应答的基础,?,免疫细胞膜表面的抗原受体,+,外来抗原的表位,?,识别很精细，包括异种之间，同种不同个体之间,2,特异性,?,即免疫具有很强的针对性,3,免疫记忆,?,对相同抗原物质的再次进入具有记忆，会产生更,快、更强的免疫应答。,免疫的基本功能,1.,抵抗感染,?,指动物机体抵御病原微生物感染和侵袭的能力。,?,免疫功能亢进,变态反应,?,免疫功
4、能低下或缺陷,机会感染,2.,自身稳定,?,清除机体产生的大量衰老死亡细胞,?,功能异常,自身免疫病,3.,免疫监视,?,肿瘤细胞的发现和清除,?,功能低下或失调,肿瘤发生,免疫的类型,一、固有免疫：,概念：出生时即有的天然免疫，经遗传获得，非特,异性，也称非特异性,/,先天性免疫。,组成：屏障结构、吞噬细胞、某些体液因子。,二、适应性免疫：,概念：出生后接触特定抗原获得的针对该物质,的免疫，也称获得性,/,特异性免疫。,包括：体液免疫、细胞免疫。,抗原,?,抗原,（,Antigen,，,Ag,）：是指进入动物机体后，,能刺激机体产生特异性免疫球蛋白或致敏淋巴,细胞，并能与其发生特异性反应的物
5、质，也就,是说具有抗原性的物质称抗原。,抗原性,包括两个方面：,1.,免疫原性,：能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细,胞的特性。,2.,反应原性,：能与由其所诱导产生的抗体或致敏,淋巴细胞发生反应的特性。,?,免疫球蛋白：,是指具有抗体活性或化,学结构与抗体相似的球蛋白。,?,抗体：,当动物机体受到抗原物质刺激,后，由,B,淋巴细胞转化为浆细胞产生,的能与相应抗原发生特异性结合反应,的免疫球蛋白。,抗,体,?,IgG,多为单体，占血清免疫球蛋白总量的,75%,80%,?,IgG1,、,IgG2,和,IgG3,的,CH2,能通过经典途径激,活补体,?,IgG,是唯一能通过胎盘的抗体,?,通过,Fc,
6、段与吞噬细胞表面,FcR,结合，发挥调,理作用；与,K,细胞结合，发挥,ADCC,作用；与,葡萄球菌,A,蛋白结合。,?,具有抗菌、抗毒和抗病毒作用,?,参与,II,、,III,型超敏反应,IgG,?,为五聚体，是分子量最大的,Ig,。,?,IgM,激活补体能力比,IgG,强。,?,IgM,是抗原刺激后出现最早的抗体，故检测,IgM,水平可用于传染病的早期诊断。,?,IgM,是,B,细胞抗原受体的主要成分。,?,也可参与,II,、,III,型超敏反应。,IgM,?,分为血清型和分泌型两种，血清型,IgA,主要由肠系,膜淋巴组织中的浆细胞产生。而分泌型,IgA(SIgA),是由呼吸道、消化道、泌
7、尿生殖道等处的固有层,中浆细胞产生。,?,主要存在于初乳、唾液、泪液，以及呼吸道消化,道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。,?,分泌型,IgA,的合成和主要作用部位在黏膜。,IgA,?,血清,IgD,含量极低。,?,膜性,IgD,存在于成熟,B,细胞表面，因,此，它是成熟,B,细胞的主要标志。它,也是,B,细胞抗原受体（,BCR,）。,IgD,?,血清中含量最低的抗体。,?,能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的,IgE-Fc,受体结合，介导型超敏反,应。,?,与抗寄生虫感染有关。,IgE,?,单克隆抗体,由一个,B,细胞分化增值的,子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原,决定簇（表位）的抗体,。,?,
8、多克隆抗体,采用传统的免疫方法，将,抗原物质经过不同途径注入动物体内，经,数次免疫后采血所获得的抗血清即为多克,隆抗体。,人工制备抗体,免疫学试验技术,?,血清学试验的类型,血清学反应的特点,1.,特异性与交叉反应性,2.,可逆性：表面的结合，有可逆性,3.,适比性：比例合适，反应才可见,4.,阶段性：不可见,可见反应,5.,条件依赖性：,pH,，温度，电解质,?,抗原抗体结合除了空间结构互补外，主,要以氢键、静电引力、范德华力和疏水,键等非共价结合。,Ag+,血清,(Ab),Ag-Ab,复合物,pH 7.0 T 37,pH,3 T,60,表面性与可逆性,?,Ag,和,Ab,结合需要适当的比例
9、，,Ag,或,Ab,过多过,少，都不能形成大的,Ag-Ab,复合物。,Ab,过剩,Ag,过剩,比例适当，交联成网络,网,格,学,说,适合比例性,?,电解质：,稀释抗原、血清常用生理盐水，但,稀释禽类血清时常用,8,10%,高渗盐水。,?,酸碱度：,稀释抗原、血清的溶液,pH6.0,8.0,均可以，为了稳定,pH,，在抗原抗体反应中最,好用,pH7.0,7.2,的磷酸缓冲液作抗原抗体稀,释液。,?,温度：,通常为37，适当提高反应温度可增,加,Ag,与,Ab,分子的碰撞机会，加速反应的出现,影响抗原抗体反应的因素,凝集试验,?,定义：,细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在,胶乳、白陶土和红细胞的抗
10、原，与相立抗体结,合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，,形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验。,凝,集反应中的抗原称为,凝集原,，抗体称为,凝集素,。,?,分类：,凝集试验可根据抗原的性质、反应的方,式分为直接凝集试验,(,简称凝集试验,),和间接,凝集试验。,一、直接凝集试验,?,细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电,解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。,?,直接凝集试验分为：玻板凝集试验和试管凝集,试验。,玻板凝集试验,?,为一种,定性,试验方法：,将含有已知抗体的诊断血清,(,适当稀释,),与,待检菌悬液各一滴在玻片上混合，数分钟后，,如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此
11、,法简便、快速，,常用于菌种鉴定或,ABO,血型鉴,定。,也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血,清中是否存在相应抗体，,如布氏杆菌的玻板凝,集反应和鸡白痢全血平板凝集试验。,、试管凝集试验,?,为一种,定量,试验方法：,常用已知抗原液与一系列稀释的受检血,清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度。,以产生,50%,凝集的最高稀释度作为血清中抗,体的效价,（亦称为凝集价或滴度）。,二、间接凝集试验,?,将可溶性抗原,(,或抗体,),先吸附于一种与免疫,无关的、一定大小的不溶性颗粒,(,统称为载体,颗粒,),的表面，然后与相应抗体,(,或抗原,),作用，,在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异,性凝
12、集反应称为间接凝集反应。,根据所用载体分：,.,乳胶凝集试验,.,炭素凝集试验,.,间接血凝试验,根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式分：,正向间接凝集反应,反向间接凝集反应,间接凝集抑制反应,协同凝集反应,正向间接凝集反应,?,用,抗原致敏载体,以检测标本中的相应抗体,可溶性抗原,载体颗粒,抗体（凝集素）,反向间接凝集反应,?,用,特异性抗体,致敏载体以检测标本中的,相应抗原。,抗体,可溶性抗原,载体颗粒,间接凝集抑制反应,?,诊断试剂为,抗原致敏的颗粒载体,及,相应的抗体,，,用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗,原。也可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为,诊断试剂，以检测标本
13、中的抗体，此称,反向间,接凝集抑制反应,。,协同凝集反应,?,与间接凝集反应的原理相似，只是所用载体既,非天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，,而是一种金黄色葡萄球菌。,它的菌体细胞壁中含有,A,蛋白,(SPA),SPA,具有与,IgG,的,Fc,段结合的特性,?,因此当这种葡萄球菌与,IgG,抗体连接时，就成,为抗体致敏的颗粒载体；如与相应抗原接触，,即出现反向间接凝集反应。,?,适用于细菌和病毒等的直接检测。,基本原理：,许多病毒表面具血凝素，具有凝,集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现,象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异,性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这,种特性可进行血清
14、学试验，称为血凝抑制试,验。,病毒的血凝与血凝抑制试验,病毒,+,鸡,RBC=,凝集（血凝试验）,病毒,+,特异性抗体,+,鸡,RBC,=,不凝集（血凝抑制试验）,沉淀试验,?,定义：,可溶性抗原,(,如细菌的外毒素、内毒素、,病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等,),与,相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉,眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验,。,参与沉,淀试验的抗原称,沉淀原,，抗体称为,沉淀素,。,?,分类：,沉淀反应可在液体中进行，也可在半固,体琼脂凝胶中进行。,液相内沉淀反应,絮状沉淀反应,环状沉淀反应,+,抗血清,抗原,+,抗原,抗体,凝胶内沉淀反应,免疫扩散技术,免疫电泳技术,单
15、向扩散试验,双向扩散试验,火箭电泳,对流电泳,免疫电泳,琼扩试验,(,Agar gel precipitation test,AGP,),琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，,l%,琼脂凝胶的孔径约为,85nm,，因此可允许各,种抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散。,Ag,和,Ab,在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处,结合成,Ag-Ab,复合物，此复合物因颗粒较大,而不能扩散，故形成沉淀带。,中和试验,(,病毒、毒素中和试验,),原理：,病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易感,动物、易感鸡胚或鸭胚、易感细胞的活性。,用途：,.,用已知血清检测病毒,鉴定病毒，诊断病毒病。,.,用已知病毒检测血清抗体,诊断
16、病毒感染，测定病毒免疫,血清效价（中和价）。,补体结合试验,1.,定义：,有补体参与，以绵羊红细胞和溶血素作指示系统的抗原抗,体反应。,2.,组成：,有,2,个系统共,5,种成分,1),检测系统：,包括已知抗原,(,或抗体,),和待测抗体,(,或抗原,),2),指示系统：,包括绵羊红细胞和溶血素,(,绵羊红细胞的特异性抗体,),3),补体：,取自豚鼠的新鲜血清,3.,补体结合反应的基本原理,1),补体可与任何抗原抗体复合物相结合；,2),指示系统遇补体后就出现明显的溶血反应。,Ag,Ab,红细胞,溶血素,补体,Ab,Ag,红细胞,补体,溶血素,溶血,（,-,）,不溶血,（,+,）,补体结合反应
17、,标记免疫技术,?,免疫酶技术,?,免疫荧光技术,?,放射免疫测定,?,免疫胶体金技术,?,化学发光免疫测定,二、按标记物分类：,一、按测定用途分类：,免疫组化技术：,用于组织切片或其他标本中,Ag,或,Ab,的定位。,免疫测定技术：,用于液体标本中,Ag,或,Ab,的测定。,免疫酶技术,将酶分子与,Ab,或,Ag,分子连接,形成稳定的结合物,（,酶标抗体,或,酶标抗原,）,不影响：,?Ab或,Ag,的免疫活性,?酶的活性,1.,Ag-Ab,反应的特异性和敏感性,2.,酶促反应的高效催化性和敏感性,原理,常用的酶与底物,常用酶,常用底物,反应颜色,辣根过氧化物酶,(HRP),H,2,O,2,不
18、溶性供氢体：,3,3二氨基联苯胺,（,DAB,）,黄褐色,可溶性供氢体：,邻苯二胺（,OPD,）,橙黄色,碱性磷酸酶,(AP),硝基苯磷酸盐（,p-NPP,）,黄色,葡萄糖氧化酶,与,HRP,类似,棕色,DH,2,+H,2,O,2,D+2H,2,0,HRP,酶联免疫吸附测定,一、基本原理,、使,Ag,或,Ab,吸附,到固相载体表面，并保持其免疫活性。,、使,Ag,或,Ab,与某种酶连接成,酶标,Ag,或,Ab,，酶标,Ag,或,Ab,既保,留其免疫活性，又保留酶的活性。,、测定时，把受检标本,(,测定其中的,Ab,或,Ag),和酶标,Ag(,或,Ab),按不同的步骤与固相载体表面的,Ab(,或
19、,Ag),起反应。,、通过,洗涤,将固相载体上未结合的,Ag,或,Ab,去除，最后结合在,固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。,、加入,酶反应,的底物后，底物被酶催化变为,有色产物,。,?,产物的量与标本中受检物质的量直接相关。,?,可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,二、,ELISA,方法的基本类型,双抗体（原）夹心法：检测抗原（体）的常见,方法,间接法：检测抗体的方法,竞争法：检测抗原或小分子半抗原、抗体,根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方法,间接,ELISA,?,用于测定抗体。用抗原包被固相载体，然后加入待检,血清样品，经孵育一定时间后，若待检血清中含有特,异性的
20、抗体，即与固相载体表面的抗原结合形成抗,原,抗体复合物。洗涤除去其他成分，再加上酶标记,的抗抗体，反应后洗涤，加入底物，在酶的催化作用,下底物发生反应，产生有色物质。样品中含抗体越多，,出现颜色越快越深。,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相,载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的,抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体,表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成,固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他,未结合的物质,加酶标抗体生成,抗体待测抗原酶标记抗体,的复合物,彻底洗涤,未结合的,酶标抗体,加底物进行,酶催化反应,根据颜色反应的,程度进行该抗原,的定性或
21、定量测定,双抗体夹心法,用已知特异性,抗体包被,固相载体,测定管加待测抗原和,一定量的酶标抗原使二者与,固相抗体竞争结合,对照管只加一定量酶标抗原,与固相抗体直接结合,分别洗涤,除去未结合,的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值，,根据对照管与测定管吸光度值之比，,计算标本中待测抗原含量,竞争法,ELISA,问题解析,、,实验室温度太低；,、,洗涤液配制不正确或使用了错误的洗涤液；,、,洗涤系统有微生物污染或含有替代洗涤模式；,、,使用了过度的洗涤次数；,、,孵育的时间太短；,、,试剂或包被板冷；,、,试剂失效或不同批号的试剂混合；,、,使用了错误的标记物，标记物配制不正确或标记物变质；,
22、、,读板时波长错误，酶标仪功能不正常；,、,阳性对照被稀释；,、,试剂盒使用次数过多；,、,试剂盒以前曾使用过。,读数偏低可能原因：,常用的免疫胶体金检测技术,?,胶体金免疫层析法,将特异性的抗原或抗体以条带状固定在,NC,膜上，胶体金,标记试剂,(,抗体或单克隆抗体,),吸附在结合垫上，当待检,样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前,移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再,移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂,的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测,带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为,诊断试纸条，使用十分方便。,聚合酶链反应,(PCR)
23、,诊断技术,PCR,实质就是模仿体内,DNA,复制过程的,特异性,DNA,扩增技术,。,变性,95,?,C,延伸,72,?,C,退火,55,?,C,Mg,2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq,DNA,聚合酶,AmpErase,Primer,靶序列,一、,PCR,技术概念和原理,二、,PCR,体系基本组成成分,?,模板,DNA,?,特异性引物,?,耐热,DNA,聚合酶,?,dNTPs,?,Mg,2+,三、,PCR,检测操作程序,1.,病料采集（采样标准、试剂盒说明书）,2.2.,病原核酸提取（,RNA,、,DNA,）,3.3.RT-PCR,反转录（,RNA cDNA),4.4.PCR,扩增,5.5.,电泳,6.6.,结果判定,
