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1、第十二章,发酵工程下游加工过程简介,一、发酵工程下游加工过程概论,1,、发酵工程下游加工过程的特点,1,）所需产物在培养液中浓度较低，且稳定性差,2,）普遍存在下游工程代价高，回收率较低等问题,?,发酵液,是复杂的多相系统,2,、发酵工程下游加工过程的一般程序,成品加工,发酵液的预处理和过滤,提取,精制,采用凝聚和絮凝技术加速固、,液分离；如产物在细胞内，还,要进行细胞破碎,提取（初步纯化）目的是除去与目标产,物性质差异大的杂质,精制（高度纯化）是采用对产品有高度,选择性的分离技术，除去与产物化学性,质和物理性质相近的杂质,最终获得质量合格的产品,3,、主要操作单元：,絮凝,离心,过滤,细胞破
2、碎,萃取,沉淀,层析,结晶,干燥,二、发酵液预处理和过滤,?,为什么要对发酵液进行预处理？,?,预处理的目的是什么？,发酵液的基本特性,?,产物浓度低,?,具有极性,?,黏度大,?,表面张力大,?,性质不稳定,一）发酵液的预处理,1,、目的：,发酵液中杂质多且成分复杂，其中对纯化影响最大的,是高价,无机离子,(Ca,2+,、,Mg,2+,、,Fe,3+,等,),和,杂蛋白,等,改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；,尽可能使产物转入便于以后处理的相中；（一般为液相）,能够除去部分杂质。,2,、高价无机离子的去除,镁离子的去除：,?,常用草酸,与钙离子生成草酸钙沉淀,?,草酸为弱酸
3、，对发酵产物的破坏较小，草酸钙沉淀,还能促进蛋白质凝固，有利于提高滤液的过滤速度；,?,草酸的溶解度较小，需大用量时，可用草酸钠取代；,草酸价格较高，生产上一般需回收,钙离子的去除：,铁离子的去除,：,?,常用三聚磷酸钠,与镁离子形成可溶性络合物,Na,5,P,3,O,10,+Mg,2+,=MgNa,3,P,3,O,10,+2Na,+,?,常用黄血盐,与铁离子形成普鲁氏蓝沉淀,3K,4,Fe(CN),6,+4Fe,3+,=Fe,4,Fe(CN),6,3,+12K,+,3,、可溶性杂蛋白的去除,杂蛋白的存在会降低离子交换树脂和大网格树脂的吸附,量，如采用溶剂萃取，会发生乳化，影响两相分离。此外，
4、,在常规过滤和膜过滤时，还会使滤速下降，使膜受到污染,。,1,）沉淀法,?,调等电点,因羧基的电离度比氨基大，所以大多数蛋白质的等电点,都在酸性范围,(pH4.0-5.5),?,但仅靠调等电点还不能使大部分蛋白质沉淀,蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子物质,如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐和,过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如,Ag,+,、,Cu,2+,、,Zn,2+,、,Fe,3+,、,Pb,2+,等,形成沉淀,2,）变性法,?,变性蛋白溶解度较小,?,最常用加热法,加热不仅能使蛋白变性，还可降低液体黏度，提高过滤速率；,?,其他方法：,大幅度调节
5、,pH,，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂,?,变性法存在一定的局限,如加热法只适用于对热较稳定的目的产物；极端,pH,也会导致某些目,的产物失活，且需消耗大量酸碱，而有机溶剂法通常只适用于所处理的,液体数量较少的场合。,3,）吸附法,?,加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而将其除去,如四环素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚,铁氰化钾的胶状沉淀来吸附蛋白；,在枯草芽孢杆菌发酵中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者,生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并,包裹在其中而除去,凝聚和絮凝都是发酵液预处理的重要方法，,其处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮,液中，改变细胞、菌体和蛋白
6、质等粒子的分,散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分,离的絮凝体，再进行分离。,发酵液预处理的方法凝聚和絮凝,凝聚,指在投加的化学物质（如水解的凝聚,剂：铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱,稳并使粒子相互聚集成,1mm,大小块状凝聚体的,过程。,电解质的凝聚能力可用凝聚值表示，即使胶粒发生,凝聚作用的最小电解质浓度（,mmol/L,）。,一般反离子的价数越高，,凝聚值越小，即凝聚能力,越强。,如,Al,3+,Fe,3+,H,+,Ca,2+,Mg,2+,K,+,Na,+,Li,+,絮凝,指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分,子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成,10mm,大小絮凝团的过程。,
7、其中絮凝剂主要起架桥作用，工业上使用到,的有聚丙烯酰胺类衍生物、聚合铝盐、海藻酸,钠、壳聚糖等，目前最常用的是聚丙烯酰胺类,衍生物。,1,）板框,(plate and frame),压滤机,板框过滤机结构图,1-,尾板,2-,滤框,3-,滤板,4-,主梁,5-,头板,6-,紧压装置,二）发酵液过滤常用设备,板框过滤机,Plate shifter,1500 x 1500 Filter Press,Cloth washing,1,）板框,(plate and frame),压滤机,2,）带式压滤机,二）发酵液过滤常用设备,?,发酵后期要少加消泡剂和少进行补料，防止消泡剂和,未用完的培养基增加过滤难
8、度；,?,菌体自溶前放罐可防止因菌体自溶释放出的代谢产物,增加发酵液黏度,影响发酵液过滤的因素,1,）菌体细胞体积,?,真菌菌丝体较粗大，发酵液不需特殊处理，易过滤；,?,放线菌菌丝细而分支，交织成网格状，较难过滤，,发酵液需经预处理，凝固蛋白质等胶体物质，提高过滤,速度；,?,细菌菌体更小，发酵液如不经絮凝等预处理，很难用,常规过滤设备进行过滤操作。,2,）培养基组成,黄豆饼粉、花生饼粉等会增加过滤难度,3,）放罐时机,当发酵液中有不溶性多糖时，会使发酵液的黏度增大而影响,过滤速度；可用酶将其转化成可溶性单糖，提高滤速。,提高过滤性能的方法,1,）加助滤剂,?,助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒
9、，能使滤饼疏松，从,而增加滤速；,?,常用硅藻土、珍珠岩等；,?,加入方法有两种：,a),预先在滤布上铺上一层,1-2mm,厚的,助滤剂；,b),直接把助滤剂加入发酵液中。,2,）添加填充凝固剂,如,CaSO,4,、,AlPO,4,等本身就是助滤剂，且能使胶状物和,悬浮物凝固,3,）酶解法,（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）,发酵液,初步纯化,细胞碎片分离,细胞破碎,细胞分离,高度纯化,成品加工,预处理,胞,外,产,物,（加热、调,pH,、絮凝）,（过滤、离心分离、膜分离,),（匀浆、研磨、酶解）,（离心分离、双水相萃取、膜分离）,（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）,（浓缩、无菌过滤、干燥、
10、成型）,胞,内,产,物,提取,精制,产,品,的,收,得,率,和,质,量,控,制,。,细胞破碎,目的代谢产物并非都是分泌型的，许多是存在,于细胞内的，特别是基因工程菌在细胞内形成的,包含体是不分泌的，故需进行细胞破碎。,?,大规模破碎细胞常用方法；,?,利用高压使细胞悬液通过针型阀，由于突然减压和高,速冲击撞击环，造成细胞破碎。,?,影响破碎的主要因素是压力、温度和循环次数,1,）高压匀浆法,高压匀浆器排出阀,2,）高速球磨法,高速球磨机,1-,物料进口,2-,物料出口,3,、,4-,冷却水进、出口,5,、,6-,夹套冷却水进、出口,由于圆盘的高速旋转，细胞悬浮液与极细的玻璃,小珠、石英砂或氧化
11、铝一起快速搅拌或研磨，使,细胞得以破碎。,3,）超声波法,?,常用超声波频率,15-25kHz,；,?,原理：由于超声波产生极为强烈的冲击波压力，引起,黏滞性旋涡在介质中的细胞上造成了剪切力，促使细胞内,液体发生流动，造成细胞破碎；,?,超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时需冷却；,?,通常杆菌比球菌易破，阴性菌比阳性菌易破,4,）酶解法,?,专一性强，条件温和；但费用较高,?,酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用,大多数微生物都能产生一种可以水解自身细胞壁的酶；当,改变一定的环境条件，可诱发这种酶的过量产生或激发其,他自溶酶产生，而发生自溶现象。,5,）渗透压冲击法,?,将细胞先放入高渗
12、透压的介质中，如高浓度的甘油或蔗,糖液，在达到平衡后，介质突然被稀释，或将细胞转入水,或缓冲液中，水就会迅速进入细胞内，致使细胞膨胀，引,起细胞壁的破裂；,?,此法适用于细胞壁较脆弱的，或者细胞壁预先用酶处理,的，或细胞壁合成受到抑制的微生物；,6,）反复冻结,-,融化法,?,将细胞反复在低温下突然冷冻后在室温下融化，引起,细胞破裂；低温冷冻一方面能使细胞膜的疏水键结构断,裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶使,细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨胀而破裂。,?,该法适用于细胞壁较脆弱的细胞,细胞破碎方法,二、提取（初步分离）,（一）沉淀法（,Precipitation,）,?,
13、沉淀是通过改变条件或加入某种,试剂，使溶液中的溶质由液相转变,为固相析出的过程。,?,方法简单、成本低、使用广泛，,初步分离的常用手段。,盐析法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,非离子型聚合物沉淀法,聚电解质沉淀法,生成盐复合物沉淀法,热变性及酸碱变性沉淀法,中性盐的加入能,破坏蛋白质的胶体性质,，使蛋白,质的溶解度降低而析出。,1.,盐析法,(Salting out),破坏了蛋白质在水中存在的两个因素,(,水化层和电,荷,),从而使蛋白质沉淀,。,将大量盐加到蛋白质溶液中，,高浓度的盐离子（如硫酸铵的,SO4,和,NH4),有很强的水化,力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是,蛋白质
14、胶粒凝结并沉淀析出。,蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、,硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。,?,盐溶,(salting in),：,许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象,（比在纯水中的溶解度大大增加）；,?,高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；,?,由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所,需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐,浓度可使各种蛋白质分段沉淀。,1,）蛋白质浓度,?,蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白,质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加,等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在,2.5-3.0%,。,2,）离子强度和种
15、类,3,）温度,?,温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加,许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；,4,）,pH,?,由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的,pH,作为盐析,pH,影响盐析的因素,2.,等电点沉淀法,原理：,利用两性电解质在电中性时溶解度最低,优点：,许多蛋白的等电点都在偏酸范围内，而许多无机酸,的价格低廉；,缺点：,酸化时易引起蛋白失活,不少蛋白质与金属结合后会发生等电点偏移，如胰岛,素的等电点为,5.3,，在与,Zn,2+,结合形成胰岛素锌盐，其等,电点升为,6.2,；故加入金属离子后选择等电点沉淀时，要,注意调整,pH,。,二、提取（初步分离）,（二）结
16、晶法,（,crystallization,）,物质从液态（液体或熔融体）或气态形成晶体,的过程叫,结晶,。,?,加入能使结晶溶质溶解度降低的物质，让结晶溶质形成,过饱和液；,例如卡那霉素不溶于乙醇，向卡那霉素脱色液中加入终浓,度为,60%-80%,的乙醇，就结晶析出,;,在普鲁卡因青霉素结晶时，加入一定量的食盐，可使结晶,更易析出,结晶方法,（过饱和溶液形成的方法）,1,）浓缩结晶,减压蒸发浓缩，达到过饱和,2,）冷却结晶,适用于溶解度随温度变化很大的物质；先加,热使其溶解，然后冷却结晶；,3,）化学反应结晶,?,加入反应剂或调,pH,，使生成更低可溶性物质,；,如在青霉素醋酸丁酯提取液中，加
17、入乙醇,-,醋酸钾，因,形成的青霉素钾盐难溶于醋酸丁酯而结晶析出。,4,）解析结晶（,drowningout,）,三、精制（高度纯化）,（一）离子交换法,(Ion exchange),离子交换工作原理,根据物质的酸碱性、极性不同，在水溶液中所带阴阳离,子不同，电荷不同的物质对层析柱上的离子交换剂有不同的,亲和力，改变洗脱液的离子强度或,pH,，不同物质就能依次从,层析柱中分离出来。,在离子交换过程中，离子首先扩散到树脂表面，通过树,脂扩散到交换位置，在交换位置进行离子交换。被交换的分,子所带电荷越多，它与树脂的结合越紧密，也就越不容易被,其它离子所取代。被交换的离子扩散到树脂表面，洗脱液通,过
18、，被交换的离子扩散到外部溶液中。,三、精制（高度纯化）,（二）色谱分离法,用微量注射器针头或微细管把样品点一,小点在层析床的一端。要求层析床必须,完全干燥，点样之后转入装有展层剂的,玻璃槽中。当展层剂的前沿跑到滤纸全,长的,80,-90,时，将层析床取出。,纸层析,?,可以用相对迁移率（,Rf,）来表示,一种物质的迁移：,?,或者也可以用相对于一种已知迁,移率的标准物的迁移（,Rx,）来表示：,待测物移动的距离,标准物移动的距离,R,x,=,组分移动的距离,溶剂移动的距离,R,f,=,薄层扫描仪,快速；,可用腐蚀性试剂显色；,易于制备少量样品。,薄层层析,十六元环大环内酯类抗生素的薄层色谱图,1:,乙酰螺旋霉素,;2:,麦迪霉素,;3:,麦白霉素,;,4:,吉他霉素,;5:,乙酰吉他霉素,
