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1、“十二五”科技规划项目2011年度项目建议书项目名称：中国人群宫颈癌遗传易感的交互性研究和应用建议单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院（马丁） 联系人： 胡继发联系电话：027-83663654电子信箱：jfahu中国人群宫颈癌遗传易感的交互性研究和应用一、项目立项的必要性及需求分析（一）阐明项目与卫生行业重大科技需求和医药卫生体制改革的关联性。宫颈癌是仅次于乳腺癌的全球女性第二大恶性肿瘤。全世界每年大约有50万新发病例，其中80%在发展中国家，中国每年有超过13万宫颈癌新发病例，约占全世界的1/3，其发病率及死亡率仅次于智利而位居世界第二；而我国宫颈癌的地域发病率相差甚远，多集中于中西部
2、山区，如湖北省五峰地区宫颈癌发病率是北京地区450倍。宫颈癌已成为严重威胁我国妇女生殖健康的恶性疾病之一。因此，深入探索宫颈癌发病机制，最终达到根除宫颈癌是关系到攻克重大疾病、保护广大妇女健康的重要课题。流行病学研究发现，包括早婚早育、不良性行为和吸烟等因素是宫颈癌的危险因素，其中又以人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)感染与宫颈癌的发生最为密切。然而，单纯HPV感染并不足以导致癌变，即使高危型HPV感染的妇女也只有少部分罹患宫颈癌。据研究证实，超过80%妇女一生中曾有HPV感染，但大部分只是一过性感染，只有不到1%宫颈癌变。当宿主基因发生突变或宿主防御机制低下时
3、，可诱导HPV基因片段整合到宿主细胞DNA，从而导致HPV持续感染。目前普遍认为在宫颈非典型增生向宫颈癌演变过程中，高危型HPV DNA整合到宿主基因组将导致宿主细胞产生包括抑癌基因功能缺陷、基因组不稳定性和细胞永生化等一系列不可逆链式反应，是宫颈癌变的重要机制之一。 可见，HPV感染是宫颈癌的重要致病因素，但并非唯一危险因素。作为明确病毒感染为病因的肿瘤，不难理解HPV感染的宿主遗传易感因素也与宫颈癌的发病风险密切相关。近期有研究认为，包括宫颈癌在内的众多肿瘤的发生发展是一个多阶段、多基因变异的过程，环境因素是肿瘤发生的始动因素，而个人的遗传特征决定肿瘤的易感性。然而，由于研究现场的缺乏、宫
4、颈癌样本采集的困难和检测策略的滞后，目前世界范围内对宫颈癌易感因素的研究尚处于起步阶段。我国是宫颈癌高发大国，有较多宫颈癌密集高发区，种族环境相对较为密闭的湖北省五峰宫颈癌高发区为中国人群遗传背景研究提供了优势场景，是国外其它发达国家所不能比拟的。本项目组前期研究对湖北省五峰地区逾万份宫颈癌易感资料分析结果表明，发现宫颈癌家族史是其独立危险因素之一；国外其它研究小组也有报道宫颈癌存在家族聚集性和种族发病率差异，这些数据直观地说明基因遗传变异所致易感性可能是宫颈癌发生的关键内在因素。从某种意义上来说，肿瘤是人体免疫监视系统功能紊乱导致的一种疾病。不可否认重要调节基因在宫颈癌发生发展中起到关键作用
5、，然而重要调节基因遗传变异是否使HPV感染人群暴露于宫颈癌易患状态？且这些遗传变异是否与HPV DNA整合密切相关？这些研究目前国内外文献罕有涉及。随着人类基因组计划的完成和国际单体型图计划(HapMap)的开展20-21，重要调节基因中存在众多的单核苷酸多态(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)也可精确甄别，而这些基因遗传变异可能与生物表型改变之间存在密切联系，从而影响个体宫颈癌的患病风险。随着HapMap的逐步完成，各种高通量和中通量基因测序技术的更新完善也为该类研究提供了前所未有的机遇。宫颈癌其演变是由高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）亚临床或潜伏持续性
6、感染、细胞学异常的慢性宫颈病变、宫颈上皮内瘤样病变（CIN）逐渐发展成癌的连续的病理过程，这种逐步演变过程提示了高效、有力的宫颈疾病筛查、防控技术的推广应用是可以有效阻断宫颈重大疾病进程的。也就是说，阻断HPV感染或HPV致癌过程则可有效阻止CIN发生，有效阻断CIN发生或规范治疗CIN则可有效阻止宫颈癌发生，保护我国妇女健康。随着现代科学技术的飞速发展，预防、早期阻断宫颈重大疾病的发生、发展已不仅仅停留在梦想。然而，国内大部分基层医院，尤其贫困地区，还未建立宫颈重大疾病卫生技术网络，缺乏灵敏度高, 特异性好的检测技术和规范化的防控及诊治措施，很难在早期宫颈病变时就及时发现，合理诊疗，往往延误
7、了关键时机。另外，目前在世界范围广泛应用的早期筛查技术还无法圈定高危人群，进行宫颈重大疾病风险评估，在社会人群和基层社区层面缺乏风险分级管理。因此，本项目的立项实施将带动国内卫生行业重大科技进展，随着本项目各项技术的集成、转化、转移和推广应用，将会使我国宫颈重大疾病的预防、诊治时相大大前移。我国每年约有3亿以上的妇女需进行宫颈疾病的早期筛查，国家卫生部投入宫颈疾病的筛查、防治的巨额经费对我国的基础医疗保险造成了很大负担，尤其是不必要、非规范、低效的筛查、诊治工作导致了医疗资源巨大浪费。本项目的实施顺应了医药卫生体制改革，以效益成本最优化为目的，构建、推广分层筛查流程，有效控制了我国用于宫颈疾病
8、筛查的医疗费用并提升了筛查效率；通过削减CIN和宫颈癌的发病率，大幅降低了我国宫颈重大疾病的诊治手术费用和不必要的大量抗癌医疗费用；同时，在节能保护卫生资源的基础上，减少了由宫颈重大疾病引起的社会生产力下降，对于稳定家庭与社会都将产生巨大效益。 综上所述，选定宫颈癌发病极端人群，以重要免疫调节基因遗传变异与HPV感染状态的交互作用为突破口，锁定宫颈癌发病内、外因铰链作用，通过遗传学、病毒基因组学、分子生物学和医学统计学的联合应用，筛查确定具有生物学功能的宫颈癌免疫遗传易感基因并进行生物学功能验证，将是揭示宫颈癌发生机制、判别宫颈癌发病风险及开发新型宫颈癌防治策略的重要环节。（二）阐明项目的重要
9、性和紧迫性 宫颈疾病是我国妇女常见病、多发病。近年来，宫颈癌发病率及年轻化趋势逐年攀升，患病和死亡人数均占全世界1/3以上，已成为威胁妇女健康和生命的最严重疾病之一。其发生是起因于HR-HPV感染、逐渐衍变为癌的连续病理过程，属于感染性疾病，是可预防和有望治愈的。随着目前国内外对宫颈癌病因和机理的深入研究，人们对宫颈癌防治的观念也应有质的转变。HR-HPV的致瘤性已得到肯定，HPV感染率在CIN1为70%78%，CIN2/3中为80%89%，宫颈癌中则超过95%。HR-HPV的存在，使35 %宫颈细胞学异常，25 %发生CIN，宫颈癌发生的危险性增加了250倍。循证医学证据表明CIN 发展为浸
10、润癌的总风险率是15%，CIN1和2发展为浸润癌的危险分别是正常的4倍和14.5倍, 而CIN 3发展为浸润癌的危险则高达46.5倍。这种演变关系明确提示了宫颈重大疾病早诊早治的重要性。我们应认识到宫颈癌预防时相已明显前移，宫颈癌防控体系实际上已转变为对宫颈HPV感染的预防和监控、细胞学异常的慢性宫颈病变及CIN的预防筛查和早期诊治。因此，正确认识和预防HPV感染应该是降低宫颈癌发病率的必要环节，加强早期宫颈疾病防控及规范化诊治的推广应用，可有效阻遏宫颈重大疾病演变过程。本项目的实施是保护广大妇女健康和生命亟待解决的重大课题。 我国是宫颈疾病流行大国，随着宫颈重大疾病呈现年轻化趋势，有效提高生
11、活质量与延长生命时间对患者的影响同样重要，而且年轻患者生育要求矛盾日显突出，必须迅速普及、提高宫颈疾病防控和诊疗水平以适应当前社会发展现况。此外，我国每年投入妇女宫颈重大疾病诊治的巨额费用对基础医疗保险已造成了巨大经济负担，尤其不必要、非规范的筛查和诊治极度浪费了非常有限的医疗资源。因此，在全国范围内推广应用宫颈疾病防控及规范化诊治措施，其社会需求迫在眉睫。二、相关领域国内外技术现状、发展趋势及目前工作基础及相关学术、行业地位（一）国内外技术现状与发展趋势：(二)目前工作基础及相关学术、行业地位：在教育部重点实验室建设的支撑和973项目和国家自然科学基金的资助下，项目组对宫颈癌易感性交互研究开
12、展了前期研究，奠定了一定工作基础：建立湖北省五峰宫颈癌临床研究基地；采集了2.8万高发区人群、癌前病变和宫颈癌临床资料；建立了较大规模的高发区宫颈癌标本库，包括：含正常宫颈、癌前病变和宫颈癌等宫颈病变病理标本库，血样遗传标本库，对应宫颈HPV DNA感染信息标本库，具病毒相关肿瘤家族史的宫颈癌患者全家族人群的血液标本、新鲜组织及宫颈分泌物标本等。采用表达谱芯片等技术对宫颈癌异常表达基因进行筛选，获取一批有重要价值的新基因，并完成了初步验证工作，为建立宫颈癌免疫相关信号通路网络奠定了实践基础；已完善基因互作网络分析等高维统计学分析技术，建立多样本聚类分析及基因批量注释、大型数据库构建及维护等领域
13、的生物信息学平台，将为芯片扫描得到的海量生物信息数据提供高效有力的分析和筛选工具。通过对HPV阳性宫颈癌患者的研究发现HPV整合感染多有E2基因序列断裂或缺失，首次证实HPV整合是HPV感染持续存在的重要分子机制。 基于以上理论依据和工作基础，本项目将研究重要免疫调节基因遗传变异与HPV感染状态的交互作用对宫颈癌发生发展的影响。主要目的是: 以HPV感染介导的免疫相关信号通路为基础的分析策略利用HapMap研究成果，以包括Fas/FasL等重要免疫调节基因内所有的单核苷酸多态间的连锁不平衡信息，选择能够代表通路内基因所有遗传变异信息的标签SNP(tagSNP)制备宫颈癌预制芯片，进行关联分析；
14、分析宫颈HPV感染信息：应用HPV基因分型技术进行HPV分型、检测病毒载量、抽提宫颈组织或分泌物DNA 分析HPV整合状态； 探讨重要免疫调节基因基因遗传变异与HPV感染状态的交互作用对宫颈癌发生发展的影响，为进一步建立宫颈癌风险预测指标提供临床基础。 对重要免疫调节基因进行体内、外生物学功能验证。在肿瘤免疫中，激活诱导的细胞凋亡(Activation-Induced Cell Death, AICD)现象是恶性转化细胞逃逸机体抗肿瘤排斥反应，死亡受体(FAS)和死亡配体(FASL)结合后产生“死亡信号“，进而引起T淋巴细胞的细胞凋亡。本课题组已完成的国家自然科学基金面上项目（项目批准号：30
15、271358和30672227）结果表明Fas/FasL下游抑制基因cFLIP高表达与HPV整合导致的HPV16 E2基因缺失呈明显正相关，高危型HPV整合后可能通过失活Fas/FasL通路逃避机体免疫监视并进行免疫反击，破坏Fas、FasL和Caspase8的正常表达，触发淋巴细胞AICD，进而促使宫颈癌变。三、下一步工作规划(一) 项目研究目标(二) 项目主要研究内容：1. 建立具有国际水平的中国宫颈癌临床资源文库和标本库，建立中国宫颈癌高发区临床研究基地，采集当地高危人群和HPV相关肿瘤家族聚集人群的分子流行病学和遗传资源。组织协作组制定统一的规范标准标本库临床资料库：正常对照、CIN和
16、宫颈癌血清、血浆和血细胞库肿瘤、癌旁、正常组织库正常和宫颈癌细胞库病理组织库和切片库人口学资料生活方式和病史资料实验室检查情况随访资料手术和放化疗情况影像检查情况多中心宫颈癌临床资源网络按标准收集资料和标本体检资料宫颈癌高发区基地1）. 制定统一的病例和对照入选标准，建立国际认可的分类分级标准，制定正常对照、CIN和宫颈癌编码体系和规范统一的病历；2）. 临床资料采集：人口学资料、生活方式资料、病史资料、一般体检资料、妇科检查资料、实验室检查资料、影像学资料、术前化疗、放疗或放化疗情况、手术治疗情况、病理结果、术后化疗、放疗或放化疗情况和随访等。制作科研电子病历，建立中国宫颈癌临床资料数据库。
17、3）标本收集：在知情同意的原则下，采集患者及对照个体（有家族史成员收集家系资料）血样（血清、血浆、血细胞）；收集部分个体宫颈分泌物；收集部分个体宫颈组织标本、病理切片等。4）. 建立高发区宫颈癌研究基地；采集湖北省五峰地区以往流行病学调查资料进行提炼和归纳总结；在知情同意的原则下，采集该地区3000个高发人群、300个以上CIN或宫颈癌患者的血样和宫颈分泌物，并对阳性病变患者采集宫颈活检组织和病理切片；采集有宫颈癌家族史的全家族血样和部分宫颈分泌物。5）建立开放共享网络体系：整个网络结构分为两层，总网站服务器放置在武汉，统一存放各中心数据，第二层为中心网络及数据。结构如下图：中国人宫颈癌资源共
18、享平台华中中心库华西中心库华北中心库华东中心库华南中心库武汉资料库湖南资料库西安资料库 沈阳资料库深圳资料库广西资料库浙江资料库待添加的隐藏文字内容2江西资料库广州资料库宜昌资料库天津资料库宫颈癌高发区基地网络河南资料库多中心宫颈癌临床资源网络2. 影响宫颈癌易感性的关键基因及多态性的分子机制研究（GWAS）针对中国宫颈癌HPV感染状态，进行大样本人群的全基因组和重要候选基因的基因的分析，建立体现中国人群遗传结构的宫颈癌易感危险性评估。总体目标是利用传统遗传学和组学/表观遗传学技术对宫颈癌的易感基因/甲基化、基因组失衡及小RNA进行检查，并对确定的候选基因及小RNA进行部分功能研究及临床应用。
19、具体目标：1)、明确全基因组宫颈癌基因组失衡及易感基因的甲基化修饰情况。2)、筛选到一批宫颈癌特异性表达或表达差异明显的小RNA和基因，建立不同亚型宫颈癌的小RNA表达数据库。3)、通过遗传标记（诊断芯片）结合HPV分型检测，建立并验证宫颈癌的新型基因筛查和诊断技术。3. 重要遗传基因变异与HPV感染在宫颈癌遗传发育中的交互作用（验证）总体目标是对不同HPV感染状态下宫颈癌人群中基因、蛋白、小RNA表达和基因组失衡、基因甲基化/乙酰化差异进行分析。通过与HPV未感染或一过性感染者比较，观察在宫颈癌发生中表观遗传学对遗传变异和易感环境的交互作用。具体目标：1）、利用HPV感染下的宫颈癌患者的基因
20、、蛋白、小RNA表达和基因甲基化的数据库，明确这些患者的基因表达/甲基化、基因组失衡与“HPV一过性感染”者的差异。2)、对常用抗宫颈癌药物进行药物基因组学和表观遗传学分析，寻找早期诊断与疗效评价模式指导下临床个体化治疗的生物遗传标记。3)、利用抗宫颈癌药物的鼠模型，重点发现宫颈癌相关基因、蛋白及基因甲基化/乙酰化水平与药物相关性。4. 以HPV持续感染状态相关基因变异为中心的调控网络失衡导致宫颈癌的机制研究：宫颈癌癌前病变过程中关键预警标志物的验证；宫颈上皮细胞恶性转化过程中的效应分子与调控机制；宫颈癌的基因组、表观遗传修饰变化及预后标志物的评价（1）整合位点相关基因变异的筛选（2）宫颈上皮恶性转化的动物模型及行为学基础研究（敲除基因变异位点后宫颈上皮恶变倾向）5. 筛选宫颈癌高危人群的预测及个体化预防的分子标志谱研究（1）高危人群的HPV持续感染和引起癌变（2）疫苗问题：宫颈癌的预防比治疗更重要。围绕上市宫颈癌疫苗在中国地区的应用，一直有很多困惑，中国人群是否适合现有HPV疫苗？什么人群适合HPV疫苗？是否只有易感人群才需要接种？如果解决易感问题，将节约数亿疫苗接种经费。(三) 年度计划、阶段目标：本项目计划五年内完成，各课题与研究内容间存在相互关联，各年度目标与计划如下：(四) 技术、经济效益、推广应用前景：1. 技术、经济、社会效益分析(五) 项目实施的风险分析：
