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1、第8章 经典色谱分离实用技术,学习目标知识目标 掌握吸附薄层色谱和纸色谱分离原理、常用分离参数和系统适用性指标；熟悉经典柱色谱、薄层色谱和纸色谱操作方法；了解色谱的分类和吸附薄层色谱、纸色谱、经典柱色谱的色谱条件选择原则。技能目标 掌握吸附柱色谱制备技术和薄层板制备、点样、展开和显色检视等操作技术；熟悉薄层色谱、纸色谱的仪器和材料；了解纸色谱和经典柱色谱的操作规程。,第1节 色谱法概述,一、色谱法,Tswett叶绿素分离实验,（1）色谱：植物色素经溶剂冲洗分离后如同白光色散成七色光带的现象（2)色谱法：用于产生色谱的分离方法（3）色谱柱（chromatographic column）装有用于分
2、离的填充物的细长管（如玻璃管、不锈钢管）（4)固定相（stationary phase）（5）流动相（mobile phase）,液体流动相气体流动相超临界流体流动相,固体固定相液体固定相,(6）色谱分离本质:利用混合物中各组分在流动相和固定相之间相互作用力（如溶解能力、吸附力、极性、亲和力等）的强弱不同，而使各组分在色谱柱中分别以不同的速度移动而达到分离的定性与定量分析的方法。,二、色谱法分类,1.流动相状态,液相色谱(LC),气相色谱(GC),超临界流体色谱(SFC),液-固色谱(LSC),液-液色谱(LLC),气-固色谱(GSC),气-液色谱(GLC),2.按分离原理分类,吸附色谱分配色
3、谱（DC）离子交换色谱（IEC)分子排阻色谱(MEC）亲和色谱,3.根据实验操作形式,柱色谱(CC）平面色谱(PC）,薄层色谱（TLC）纸色谱（PC)薄膜色谱（TFC）,三、色谱法的特点,分离效能高,分离与分析功能兼备,自动化程度高,应用范围广,第2节 经典柱色谱技术,一、液-固吸附柱色谱技术,1分离原理,（1）液-固吸附柱：色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液体的柱色谱法,（2）分离机制:吸附剂表面对不同组分吸附力的不同和流动相对各组分的溶解能力（或称解吸能力、洗脱能力）的差异，最终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序（或在色谱柱中停留的时间即保留时间）不同而达到分离。（3）应用:分离酸性
4、及中性化合物(如醇类和芳香烃等),2吸附剂,（1）硅胶(SiO2XH2O)A.吸附机制：表面有许多硅羟基（-Si-OH）的氢键作用 B.吸附活性 C.失活或脱活 D.活化,硅胶活性与含水量的关系,（2）氧化铝,A.吸附机制:其表面铝羟基（Al-OH）的氢键作用B.活性,C.氧化铝分类及应用范围,（3）聚酰胺,A.吸附机制：通过分子内的酰胺基与酚、酸、硝基、醌类化合物形成氢键而产生吸附作用 B.应用范围：适合于含-OH 的天然产物的有效成分分离,（4）大孔吸附树脂,A.吸附机制：大孔网状结构的高分子化合物，不溶于酸、碱及有机溶剂，吸附性与筛分性原理相结合 B.应用范围：主要用于水溶性化合物(如皂
5、苷）的分离纯化,3流动相(又称为洗脱剂),（1）流动相影响因素A.被测物质的结构、性质 物质的结构 常见官能团的极性由小到大的顺序是：烷烃烯烃醚类硝基化合物酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸类。B.流动相极性:相似相溶 C.吸附剂活性,官能团极性与数目结构空间排列,（2）如何选择流动相？,最佳方案总是实验确定,想一想 在吸附色谱中，以硅胶为固定相，当用三氯甲烷为流动相时，样品中某些组分保留时间太短，若改用三氯甲烷甲醇（1:1）时，则样品中各组分的保留时间是变长，还是变得更短？为什么？,4吸附柱色谱操作技术,（1）装柱 A.质量要求 装柱之前，先将空柱洗净干燥，再将空柱垂直固定在铁架台上。如果
6、色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面平铺上一层厚0.51cm的洗过、干燥石英砂，有助于分离时色层边缘整齐，加强分离效果。柱的长度与直径比一般为10 20:1。色谱柱的填装要均匀，不能有气泡。B.装法湿法装柱 干法装柱,（2）加样,干法加样 湿法加样,（3）洗脱,洗脱剂 一种溶剂或几种溶剂按一定比例组成混合溶剂 操作要求 A.保持吸附层上方有一定量的洗脱剂，防止断层和旁流 B.控制洗脱剂的流速（510滴/min),（4）收集,等份收集(亦可用自动收集器)按变换洗脱剂收集,（5）检验可以为后续操作,二、凝胶柱色谱技术,1分离原理,（1）凝胶(2)分离原理 凝胶的
7、孔穴大小与被分离组分大小相当，尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥先流出色谱柱。尺寸小的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，最后流出。,2固定相,(1)无机凝胶又称硬质凝胶-多孔硅胶、多孔玻璃珠 性能：化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱分离效能较低(2)有机凝胶又称半硬质凝胶 性能：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱分离效能较高。但在有机溶剂中有轻度膨胀。(3)新型凝胶-葡萄聚糖凝胶,3流动相,（1）要求 流动相必须与凝胶本身非常相似，能溶解样品，浸润凝胶，且具有较低的黏度，有利于大分子
8、的扩散(2）选用方法 水溶性样品-水溶液为流动相 非水溶性样品-有机溶剂为流动相(3）常用的流动相 四氢呋喃、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷和水等,4凝胶柱色谱操作技术,（1）溶胀（2）装柱（3）加样（4）洗脱（5）再生 用恰当的方法除去凝胶中的污染物，使其恢复其原来的性质 交联葡萄糖凝胶-温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L的氯化钠的混合液浸泡，用水冲洗到中性聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶-盐溶液浸泡，用水冲到中性,第3节 薄层色谱分离检测技术,一、分离原理 薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄层板一端的起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜的流动相（薄层色谱
9、法中又称为展开剂）展开。因吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对不同组分的解吸能力也不完全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有快有慢，经过一段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互分离的斑点,薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)将固定相均匀平铺在光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法 可分为吸附、分配、分子排阻色谱法等,二、薄层色谱参数,1比移值(1）定义 组分迁移的距离与展开剂迁移的距离之比,(2)计算方法,2相对比移值,(1）定义 指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比,(2）计算方法,(3）特点消除系统误差，值
10、的重复性和可靠性都比 好,3分离度,（1)定义衡量薄层色谱分离效果的重要指标，是指相邻两斑点中心至原点的距离之差与两斑点平均径向宽度（径向宽度是指斑点沿着展开方向的宽度）的比值,(2）计算方法,三、仪器与材料,1吸附剂,粒径 540,硅胶,聚酰胺,微晶纤维素,氧化铝,硅藻土,常用,硅胶H硅胶G硅胶GF254硅胶HF254,想一想 H、G、F各代表何种意思？试解释硅胶HF365？,2载板,种类,要求 表面光滑、平整清洁,玻板处理措施清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用蒸馏水或去离子水冲洗，表面应不附水珠，晾干备用,3点样器,手动,全自动点样仪,定量毛细管,平口微量注射器,3展开容器,平
11、底色谱专用展开缸,双槽薄层色谱专用展开缸,4显色剂,5显色装置,喷雾瓶,浸渍槽,蒸气熏蒸-双槽展开缸,6检视装置,紫外分析仪(三用),摄像设备,薄层色谱扫描仪(CS9301型）,四、操作技术,1薄层板制备,自制薄层板,市售薄层板,无黏合剂,分类,含黏合剂,10%15%煅石膏,0.2%0.5%羧甲基纤维素钠水溶液,操作方法,普通薄层板(玻璃、聚酰胺薄膜和铝基),高效薄层板（固定相粒径为57）,分类,操作方法临用前一般应在110活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁,操作方法,将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除表面的气泡
12、后，置玻璃板上使涂布均匀，或倒入涂布器（见图8-14）中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为0.2mm0.3 mm)，取涂好的薄层板，置水平台上于室温下晾干后，在110活化30分钟，立即置于有干燥剂的干燥器中备用。,手动涂布器,2点样,普通板点样基线-距底边2.0cm 圆点状-R3mm条带状-宽度510mm 点或条带间距-8mm 点样量-10,高效板点样基线-距底边0.81cm 圆点状-R2mm条带状-宽度48mm 点或条带间距-5mm 点样量-5,3.展开,（1）展开要求,查阅 A.何为边缘效应?何因?如何防止?B.展开剂加入量?展开剂展开距离?,（2）展开方式,上行近水平双向多次
13、,上行展开,近水平展开,五、检测技术,1系统适用性试验,检测灵敏度,比移值,分离效能,2鉴别,等浓度对照法-同板-大致同位、同大、同色泽,等体积混合法-斑点单一、紧密,结构相似对比法-Rf不同或两斑点,4定量方法,（1）目视比色法-半定量法（精度10%）,（2）斑点洗脱法,（3）薄层扫描法(正在减少使用),第4节 纸色谱分离技术,一、分离原理(液-液萃取)利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性（或分配系数）不同，当流动相携带样品流经固定相（被吸附或固定在惰性材料上的液体）时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解、再萃取，样品经过多次反复分配后，造成分配系数稍有差异的组分移行的距离不同面实现分
14、离.,二、仪器与材料,1色谱滤纸,想一想:色谱滤纸如何选择?,2展开剂,（1）纸色谱固定相一般是什么?,（2）纸色谱展开剂如何选择?,3展开容器 圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭,下行纸色谱展开缸,三、操作技术,1色谱滤纸的准备,（1）用于下行法的色谱滤纸,（2）用于上行法的色谱滤纸,2点样 样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，点样直径为2 mm4mm，点样量取决于色谱滤纸的薄厚程度和显色剂的灵敏度，一般几到几十微克。点间距离约为1.5cm2.0cm，样点通
15、常为圆形，也可点成条形。,3展开,纸色谱下行展开,纸色谱上行展开,4斑点定位,纸色谱法斑点的定位基本和薄层色谱法相似，但纸色谱法不能使用腐蚀性显色剂，也不能在高温下显色。运用纸色谱进行药物的鉴别、检查和含量测定的方法、要求与薄层色谱法一致,第5节 应用案例,一、柱色谱法的应用案例,案例8-1 黄芪含量测定中样品溶液的制备,1.黄芪中主要活性成分是什么?如何提取和纯化?2.提取液用氨试液洗涤的目的是什么?3.D101水洗和40%乙醇液洗脱液为何弃去?,二、薄层色谱法应用案例,案例8-2 六味地黄丸中牡丹皮的鉴别,1.牡丹皮 的鉴别指标是什么?鉴别原理是什么?2.为何选择环己烷-乙酸乙酯（3:1）为展开剂?显色方式是什么?,3鉴别结果,六味地黄丸薄层色谱图（1.丹皮酚；25.六味地黄丸）,案例8-3 甲苯咪唑中有关物质检查,1.TLC法检查杂质常用有哪些方法?2.检查中为何采用硅胶GF254?3.甲苯咪唑中有关物质的限度是多少？,
