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1、实验一 微藻的培养基配制,一、实验目：掌握微藻的培养基配制方法。以海水单胞藻培养液通用配方“f/2”为例,二、实验原理 藻类的培养液必须具备藻类的生长繁殖所需要的各种营养元素，并且营养盐的比例应该符合藻类生长繁殖的需要。不同种类的微藻对营养盐的质和量的需求不同，各有其特殊性，因此，制定某种微藻的一个培养液配方时，首先必须进行一系列的试验，了解这该种藻类对营养的要求，并在使用中验证配方的效果，加以改进，使配方达到更理想的水平。藻类对营养盐的需求也有很多共同点，因而一些培养液配方（如F/2）可应用于多种藻类的培养。,进行微藻培养时，可根据培养藻类对营养的要求，选用合适的配方，在消毒水中按配方加入各
2、种营养物质配成。所加肥料应保持清洁，某些不清洁肥料必须消毒，预防敌害生物通过肥料污染。,绿藻培养液配方：海洋三号扁藻培养液（海洋研究所，1960）：NaNO3 0.1g 2Na3C6H5O7 11H2O 0.02gK2HPO4 0.01gFe(SO4)3(1%溶液)10滴 海水 1000ml亚心形扁藻培养液（湛江水产学院）：NaNO3 0.05g 维生素B12 200mgKH2PO4(1%溶液)0.005g 人尿 2mlFeC6H5O7 0.2ml 维生素B1 200g 海水 1000ml培养亚心形扁藻及其他绿藻使用，多用于小型培养和中继培养，如能加入海泥抽出液20ml，效果更好。,硅藻培养液
3、配方：艾伦-内尔森（Allen-Nelson）培养液Allen，E.J.et al（1910）：A.KNO3 20.2g 纯水 100mlB.Na2HPO4.12H2O 4.0g CaCl.6H2O 4.0gHCl（浓）2.0ml 纯水 80mlFeCl3（溶液）2.0mlB液的配制法：先把氧化钙4g溶解于40ml纯水中。另外把磷酸氢二钙4g溶解于40ml纯水中，再把三氯化铁溶融液2ml，缓慢滴入，摇动，产生白色沉淀，加热，缓慢滴入浓盐酸2ml，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上两溶液混合。使用时，取A液2ml和B液1ml，加入1000ml海水中，充分混合后加热消毒，消毒后静置24h，然后将上层
4、清夜倒出使用。,培养液是根据培养液配方配制的。为了减少每次称量的麻烦，固体的营养元素一般都配成母液（如浓缩1000倍的母液），在使用时，只要吸取一定的量加入培养液中即成。主要营养元素可以单项营养元素配成母液，也可以分成若干组，每组2种或多种营养元素同配在一起。微量元素和辅助生长有机物质也多种组合在一起，配成母液。在浓营养溶液中一般生物因不能忍受而死亡。,三、实验材料及用具1、器材电炉；灭菌锅；pH计 500ml 试剂瓶（每组5个）；玻棒、500ml烧杯、50ml容量瓶（每组一个）/牛皮纸、细绵绳 2、试剂：蒸馏水、海水各种试剂NaNO3;NaH2PO4；FeCl3 EDTA；Na2SiO3.9
5、H2O；盐酸硫铵素(VB1)；Biotin VH,三、实验步骤（一）F/2(+Si)培养基母液的配制（用去离子水配制）1.A液 500 ml 1000倍NaNO3 37.5 g;NaH2PO4 2.5 g2.B液 500 ml 1000倍Fe-EDTA 2.5 g(FeCl3 1.6 g+EDTA 0.9 g)3.C液 500 ml 1000倍 Na2SiO3.9H2O 10 g,4.D液 500 ml 1000倍 盐酸硫铵素(VB1)5 mg(试剂 50 mg/ml取100 l)Biotin VH 0.025 mg(试剂 0.1 mg/ml取250 l)VB12 0.025 mg(试剂 0.
6、25 mg/ml取100 l)先用维生素分别用纯水溶解混合，稀HCl将pH调到4.55.0，最后用纯水稀释至1升。膜过滤后冰冻保存。5.E液 500 ml 1000倍 CuSO4.5H2O 0.0098 mg；ZnSO4.7H2O 0.022 mg CaCl2.6H2O 0.01 mg；MgCl2.4H2O 0.180 mg Na2MoO4.2H2O 0.0063 mgA、B、D、E高压灭菌备用,（三）F/2培养基配制1000 ml(1升)F/2(+Si)培养基=1000 ml(1升)过滤灭菌海水+1ml A液+1ml B液+1ml D液+1ml E液(+1ml C液)注意：煮沸的海水放置凉后
7、（50度以下）再加母液，否则会出现沉淀。,（二）海水处理沉淀 砂池过滤（抽滤）灭菌（海水放于三角瓶中，置于电炉上煮沸，可杀来一般细菌）,实验二 单细胞藻类的培养,一、实验目的掌握单细胞微藻的实验室培养(藻种培养)方法，细胞生长曲线观察。,二、实验材料及用具1、实验材料：小球藻（500ml）、等鞭金藻、扁藻2、实验仪器：可见分光光度计、显微镜（1部/组）、血球计数板（一个/组）、电炉、灭菌锅、pH计、500ml烧杯（1个/组）、胶头滴管（3支/组）、250ml锥形瓶（每组3个）、牛皮纸、细绵绳3、试剂：蒸馏水、海水、碘化钾,三、实验步骤1、培养基配制：见实验一2、接种：一般培养的接种量为1/31
8、/5.3、计数：分光光度计测定500nm（OD500）和750nm（OD750）吸光值；细胞计数板计数。4、每天测定一次，分别绘制以OD值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生长曲线，分析细胞数目与OD500和OD750的相关性。5、观察并描述微藻不同生长时期的特点,小球藻,扁藻,球等鞭金藻,1、血球计数板计数方法：,（1）搅拌：由于藻类细胞在培养液中分布不均匀，所以在取产前必须进行搅拌，搅拌后立即取样。（2）固定、稀释：运动细胞需加碘液杀死才能计数。如细胞浓度过大，计数困难，需把水样稀释到适宜的程度。（附：鲁哥氏液（Lugols Solution）又称碘液，常用的配方是：将6克的碘化钾溶于
9、20毫升水中，待完全溶解后加入4克碘，摇荡，待碘完全溶解后，加入80毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。）（3）计数板与盖玻片洗净擦干盖好盖玻片摇荡藻液吸取藻液（干的微吸管）迅速加样1分钟后低倍镜下计数计数任何对角两大格（加盖玻片后每一大格即形成一个体积为0.1立方毫米的空间），然后取其平均值。每个样品须重复计数两次。1毫升水体藻细胞计算平均值10,000藻稀释倍数,2、分光光度计定量法 比色皿用75酒精消毒后，将藻液摇匀，倒入2/3体积，在两个波长下测定吸光度值。注意分光光度计测定前要调零和调满度。,作业:1、分别绘制以OD值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生长曲线(三张图)，分析细胞数目
10、与OD500和OD750的相关性（两次相关性），比较哪个波长下的密度值更能代表藻细胞数目。5、观察并描述微藻不同生长时期的特点。,实验三 藻类细胞叶绿素的提取和细胞色素的观察,一、实验目的 掌握大型和微型海藻叶绿素测定方法。观察比较不同门藻类的叶绿素的吸收光谱。叶绿素含量是衡量大型海藻生长状态的指标之一。浮游植物叶绿素含量，可用来初步估量浮游植物的光合作用能力，并进行估量水域初级生产力。也适用于评价实验室单种生长状况。,二、实验材料及用具1、实验材料：海带、裙带菜、紫菜、小球藻、球等鞭金藻等,选4种藻2、实验仪器：紫外分光光度计(208实验室)3、实验器材：研钵（每组一套）、15ml离心管（每
11、组4支-依藻种类定）、15ml刻度试管（每组4支）、0.45m的滤膜（每组3个），抽滤装置，离心机（或用20ml针管和滤膜器）4、试剂：丙酮（分析纯）、MgCO3,三、实验步骤,1、抽滤：减压过滤5ml的藻类培养液到玻璃纤维滤片上，约加0.1g MgCO3细粉，使均匀覆盖于薄膜上，倒入水样抽滤，注意避免高温、强光及压力过高，水滤完后，应继续抽气数分钟，以尽量吸尽滤膜上水分。,2、储存：将折膜放入样品储存装置中，置黑暗、干燥、低温处保存。,3、研磨和提取：把滤膜放到一个组织研磨管内的底部，加入23ml的90丙酮，把杵插入管内，研磨，在弱光下将滤得的试样研磨1到2min，再用5ml的90丙酮把杵上
12、和研磨管内的东西洗入15ml的有螺旋盖的离心管内，静置于暗处10min，使色素充分被提取。（观察叶绿素荧光）,4、离心：（2000g）5min，离心，5、测定：将上清液用90丙酮定容25ml，在分光光度计上，用1cm的比色皿分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90的丙酮作校正吸光度测定。,6、计算：分别从663、645、630nm时的光密度值，减去750nm时的光密度值，再除以液槽光程（厘米），即为D663、D645、D630的值。下式计算叶绿素在90丙酮中的含量。联合国教科文组织国际工作组推荐公式Chla（mg/ml）=11.64*D663-2.16*D6
13、45+0.1D630Chlb（mg/ml）=3.94*D663+20.97*D645-3.66D630Chla（mg/ml）=5.53*D663-14.81*D645+54.22D630,7、叶绿素吸收光谱的测定：将提取的叶绿素放于(石英)比色皿中，用紫外分光光度计测定400nm-750nm波段的吸收光谱。三、作业：1、计算几种藻类的叶绿素含量2、比较并说明不同藻类的叶绿素吸收光谱有何异同，并分析原因,实验四 微藻的分离方法-微吸管分离法,一、实验目的 1、单胞藻类的培养，首先需要有藻种。原始的藻种是从天然水域混杂的生物群中，运用一定的方法，把所需要的个体，分离出来，而获得单种培养。2、若藻种
14、受敌害生物及其他杂藻的污染也要通过分离进行纯化。本实验的目的是使学生了解单胞藻的分离方法，掌握单细胞藻类的微吸管法分离技术。,二、实验材料及用具1、实验材料：扁藻，球等鞭金藻或小球藻2、实验仪器：显微镜3、实验器材：细玻璃管或毛细管；载玻片；小试管；脱脂棉；纱布；酒精灯4、试剂：灭菌海水；F/2培海水养基,三、实验步骤,1、采样：水样可取自天然水域、养殖池、湖泊、溪流及特殊水域环境等。此外，培养水生生物的或储水的各种容器、水池，均可能生长大量浮游或附着藻类，也是采样的理想场所。2、拉制微吸管：选直径5毫米的细玻璃管，或者其它任何适合拉成毛细管的巴氏滴管，用镊子夹住滴管的前端，放在酒精喷灯的外焰
15、上，直到玻璃变软，迅速移离火焰，同时快速拉成毛细管。,4、将装有藻细胞的试管置于适宜的条件下培养。,三、实验步骤,3、分离：镜检待分离的藻液，调藻液浓度为5-6个藻细胞为宜，在已灭菌的载玻片上滴加6滴消毒培养液，另取一载玻片滴一滴稀释的待分离藻液，在显微镜下用微吸管吸取所需的藻细胞，放在第一滴消毒水中，清洗，再用微吸管吸取所需的藻细胞放在备有培养液的试管中。,实验五 微藻的分离方法-平板分离法,一、目的：学生掌握平板分离单藻种的方法。适用于能在固体培养基上生长的种类。,二、实验材料：F/2海水培养基；琼脂糖；玻璃棒；培养皿（每个同学一副）；干燥箱、高压灭菌锅、电炉；封口膜,三、实验步骤：1、平
16、板培养基的制备：该培养基的制备包括调配、融化、分装、灭菌四个步骤。调配：按分离种类的需要选用合适的营养盐配方配成培养液，加1%琼胶（又称冻粉），琼胶剪成细片，加入培养液中浸泡12小时。融化：把培养液加热，不断搅拌，使琼胶完全融化。在加热过程中，水分要蒸发不少，在加热完毕应以淡水补充蒸发掉的水分。分装：稍冷后即分装于培养皿中，装的厚度依培养皿大小而定，在0.3-0.5厘米之间。,三、实验步骤：2、平板分离方法：经灭菌的固体培养基冷却后，培养基凝固成固体状态，即可进行分离。（显微观察待分离的藻液并调节藻液浓度为1000-5000个/毫升）划线法：把一个金属接种环在酒精灯火焰上灭菌后，蘸取需要分离的藻液轻轻地在平板上划折线。喷雾法：将需要分离的藻液稀释，装入经消毒过的小型喷雾器中，打开培养皿盖，把藻液喷射在培养皿表面形成分布均匀的一薄层水珠。涂布法：滴1-2滴自然采集物于琼脂的边缘。用一弯玻璃棒（将棒浸入70%酒精溶液，放在火焰上点燃并移离火焰；重复几次。）在无菌条件下将滴在琼脂上的自然采集物滴平涂在琼脂表面上。,3、将待分离的藻液喷在固体培养基上，然后盖好，放在光亮处培养。,实验六 褐藻胶的提取,
