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1、校长:谭向勇/教授2010/06/07,北京工商大学工作汇报,酵母抽提物中滋味物质分析,北京工商大学宋焕禄2013/05/09,概述,在食品工业中，酵母抽提物作为提供肉汤味、肉味风味的咸味食品配料，被用于肉制品、汤料、酱和方便食品中。有关酵母抽提物中风味物质，以往的研究大都集中在其挥发性的气味成分上。,Farmer教授团队对3种不同的YE膏进行了分析，结果表明，2-甲基-3-呋喃硫醇、2-甲基-3-甲硫基呋喃、3-甲硫基丙醛、1-辛烯-3-酮、二甲基三硫化物以及一些吡嗪、噻吩是关键的气味活性化合物。这3种YE产品由于其加工处理及生产批次的不同，其气味化合物的种类及强度均有差异，说明YE中的风味
2、前驱物（flavor precursor）的变化对最终产品的风味起到了较大影响。,Schieberle教授团队比较了自制YE与商品YE加热后产生的关键气味活性化合物进行了比较，结果表明，YE制备方法的不同引起了两种YE加热后关键风味成分的明显差异。尤其是，YE风味前驱物之一的氨基酸含量的不同与一些关键气味活性化合物的浓度，直接相关，例如烧烤味/咖啡味的2-呋喃甲硫醇浓度与半胱氨酸含量成正比，但是爆米花味的2-乙酰基-1-吡咯啉的浓度与其前驱物鸟氨酸含量并不成线性关系。因此，弄清YE中的风味前驱物的种类及浓度，及其对加热后所产生的关键气味活性化合物的影响是非常必要的。,但是迄今为止，人们对酵母抽
3、提物中滋味活性物质的知识非常有限。蛋白质水解产生的L-谷氨酸和L-天门冬氨酸，与核酸降解产生的琥珀酸、5-肌苷酸、5-鸟苷酸一起使用会产生显著的协同效应，对酵母抽提物的鲜味有很大的贡献。,一些肽类、核苷酸衍生物、美拉德反应产物是具有浓郁鲜味或醇厚味的增味剂，使得其能够增加相关食品的美妙感觉，而同时又降低了谷氨酸单钠盐（味精）、核苷酸钠盐、NaCl的加量，从而导致了钠离子摄入量的降低，起到了增鲜、增浓厚味、减盐、减少味精加量的作用，这符合当今的营养健康理念，顺应了时代发展的潮流。因此，开展这样的研究，对于揭示食品美味的化学本质，为生产健康食品提供扎实的科学基础，意义重大。,.酵母抽提物中风味前驱
4、物分析,滋味是食品感官质量最重要的属性之一，主要是通过舌头的味蕾感知，其次是自由神经末梢，是水溶性物质刺激味觉感受器再经过味觉神经传入到大脑的味觉中枢，经分析整合产生的化学感应。滋味一般由甜味、咸味、苦味、酸味和鲜味5种基本味觉构成。,YE中主要滋味物质主要有氨基酸、还原糖、核苷酸、硫胺素和多肽等，一方面它们本身具有滋味，赋予产品良好的口感，如鲜味、醇厚味等；一方面也可以作为风味前驱物，参与美拉德反应，产生挥发性的肉香味物质，使产品具有诱人的香气。,3、Gouda 干酪中浓厚味(kokumi)物质,T.Hoffman等用凝胶过滤色谱（GPC）、液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）技术结合
5、感官评定手段，对成熟期为44周的Gouda干酪中的水溶性物质进行了研究。结果表明，其中的含-谷氨酸的二肽如-Glu-Glu、-Glu-Gly、-Glu-Gln、-Glu-Met、-Glu-Leu和-Glu-His是首次鉴定出的关键浓厚味（kokumi）物质。,本研究主要对YE中主要滋味活性化合物进行含量的测定，重在与滋味感官评价相结合，分析滋味活性物质对YE滋味感官的贡献以及作为调味增鲜作用的主要原因。,1.滋味感官评价方法,10个评价员（4男6女，23-50岁），有超过200h的感官评价经验，表3.1为香味感官评价参考标准。称取样品3g，溶于20g蒸馏水中，用嘴品尝（不咽），采用10分制（0
6、-2 弱，3-4 较弱，5-6中，7-8 较强，9-10 强）对各滋味特征进行打分。室温条件下，对每组样品评价后休息3min以免疲劳，并重复三次。,表1 滋味感官评价参考标准,图1 滋味感官评价结果,如图1所示，特征风味YE的整体滋味强度较高于基础风味YE，具体表现在肉味、鲜味和咸味。YE中，肉味、鲜味和咸味占主导地位，其次为甜味、酸味、以及极少的苦味和不良滋味。,样品来源,安琪酵母股份有限公司的样品：非肉味YE（LA00、LB05）、各种肉味YE（TB、TP、TC）。,2.游离氨基酸的测定,样品处理：（1）称量样品并移入50mL容量瓶中（2）用3%磺基水酸溶液溶解样品并定容（3）摇匀样品溶液
7、后过滤，离心，上机 分析仪器：日立L-8900氨基酸分析仪,表3 具有基础风味和特征肉香味YE中游离氨基酸含量（g/100g）,从表3可以看到，基础风味型YE(LA和LB)总氨基酸含量较高，分别为22.31g/100g和18.526g/100g，特征风味即猪肉、牛肉、鸡肉风味YE(TB、TP和TC)中总AA含量相当，在10-11g/100g。,另外，5种YE中鲜味氨基酸Glu含量远远高于其它氨基酸，最高LA中4.231g/100g，最低TP中3.608g/100g，这可能就是YE作为调味增鲜的一个重要原因。其次是甜味氨基酸Ala，最高LA中4.192 g/100g，最低TP中1.132g/10
8、0g。,图2 游离氨基酸的柱状分析图,3.游离核苷酸的测定,（1）基本原理：IMP与GMP在紫外光区域均有特征吸收，而且最大吸收波长相近，因此，它们的吸收光谱重叠干扰严重，这样不能利用单一物质的定量分析方法来对其进行分析，只能根据双波长测定的加和性原理，在适当的波长 1和 2，分别测定混合物的吸光度及等量IMP、GMP的吸光度，利用双波长分光光度法原理计算混合物中的IMP、GMP、I+G的含量。分析仪器：UV-2550紫外分光光度计,比耳定律：A=*b*C 式中：A 为吸光度值；为吸收系数；b为吸收池厚度（1cm)；C 为物质浓度“若各组份的吸光性符合比耳定律，则其总吸光度为各组分吸光度之和”
9、-吸光度加和性原理,（2）样品前处理 A）称取m=3g样品，加入6ml 0.6M的高氯酸溶液；B）在4、8000r/min离心，过滤；C）用2M的氢氧化钾调节pH 5.4，同样条件下离心，过滤；D）冰箱放置，备用。,（3）吸光系数的计算A）分别精确称取1.0000 g的IMP与GMP，溶于纯水中，定容到1 000 mL，B）准确吸取4mL，加入25mL 0.1molL HCI溶液，再用纯水定容到250 mL配成标准溶液，C）分别在250 nm、280nm波长下测定吸收值同时干燥失重测定.,表4.IMP及GMP的相关测定数据 名称 质量 g 水分含量%浓度%A250 A280 IMP 1.000
10、3 22.93 0.00123 0.269 0.054 GMP 1.0006 18.82 0.00130 0.359 0.254,=218.6992=43.9024=276.1538=195.3846,根据本实验条件,从而推算出IMP与GMP在I+G混合物中的含量为：,表5 双波长紫外法测得YE中核苷酸二钠的含量（g/100g),表5显示，GMP含量占3.2748.003%，IMP含量占0.0726.088%。且所测的五种YE中，GMP含量均高于IMP含量，并且GMP阈值（0.125%）较低于IMP（0.025%），相对鲜度GMP（16000）远大于IMP（4000），这也决定了更高含量的GM
11、P对YE的整体鲜味贡献更大。I+G总含量在5.60714.091%，特征牛肉风味YETB中I+G总含量最高，特征鸡肉风味YETC 中I+G总含量最低。,GMP回收率为99.12%108.34%。IMP回收率为99.68107.23。稳定性试验测定结果基本不变，RSD 均 2.0，说明样品稳定性良好。重复性试验中GMP、IMP、I+G的 RSD 分别为0.4、0.6、0.3，均2.0。说明样品重复性良好。,4.还原糖的测定,4.1 实验原理 DNS（3,5-二硝基水杨酸）法4.2 实验步骤4.2.1样品中还原糖的提取准确称取2gYE，放在100ml烧杯中，先加10ml蒸馏水搅拌，后加入30ml蒸
12、馏水，混匀，于50 恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出后，过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。,4.2.2 回收率的测定取等量样品，加入1mL葡萄糖标准溶液，按照同样处理方法提取还原糖，定容，在540nm处测定吸光度。,表5 DNS法测定YE中还原糖的含量（g/100g）,标准曲线方程为Y=0.628X，R2=0.9998。测得还原糖含量TB最高为2.512g/100g，LB最低为0.900 g/100g。特征风味YE（TB、TP和TC）还原糖含量要高于基础风味型YE（LA和LB）。回收率在97.34112.61%，预处理方法达到较好效
13、果。,.酵母抽提物中滋味肽的分离与鉴定,1.概述,滋味肽，也称呈味肽，是指从食物中提取或由氨基酸合成得到的对食品风味具有一定贡献的分子质量低于5000Da的寡肽类，包括特征滋味肽和风味前体肽。滋味肽存在于肉类、奶酪、海鲜、水果或蔬菜等各种食物中，无论对于加工食品还是未经加工食品的风味都非常重要。,滋味肽的分离纯化方法很多，根据分子量大小，可以选择超滤、离心等进行初步纯化，然后可以用层析、离子交换、凝胶等进行精制层析，并通过高效液相等进一步分离纯化。本研究结合滋味分析新技术即比较滋味稀释分析，找出最大稀释因子比的馏分对其进行结构鉴定，并对鉴定的多肽在热反应后产生的香味活性化合物进行了初步探索。,
14、2.滋味肽的分离,2.1 样品前处理称取YE（LA）10g，加入100ml高纯水，充分溶解。4冷冻离心20min，取上清液移入蒸发皿中，薄膜密封后，扎出多数小孔，在-80冷冻干燥。每次准确称取干燥粉末0.010g，定容于10mL容量瓶中，进样。,2.2 凝胶色谱纯化,凝胶色谱纯化依据被分离物的分子量大小不同来进行分离的一种色谱技术。当混合肽溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的肽段先出来，分子量小的物质后出来。肽分离柱Sephadex peptide 10300mm，柱体积为24mL，洗脱剂为纯水，流速确定为0.3mL/min，检测波长为254nm，上样量为100L（样品浓度：1mg/100L)
15、。,蛋白质溶液在238 nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50500 mg/mL已知浓度的5.0 mL蛋白质溶液，测定238 nm的光吸收值A238，以A238为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。,2.4 比较滋味稀释分析(cTDA),将各组馏分冷冻干燥后，称量0.010g两份，一份溶入蒸馏水(2ml，TDAwater)，一份溶入谷氨酸钠溶液（3mmol/L，TDAMSG)。以2n依次稀释，直至能够品尝到鲜味的最大稀释倍数，即为滋味稀释因子（TD factor）。,3.滋味肽的鉴定,3.1 样品前处理准确称量
16、筛选出的干燥成粉的馏分0.010g，用蒸馏水定容于10mL容量瓶中，然后用注射器吸取2.0mL过滤膜于进样瓶，待测。,3.2 HD-MS 进行LC-MS/MS分析的条件,液相条件：nanoACQUITY UPLC超高效液相色谱系统配备自动进样器，富集柱为Symmetry C18，180m x 20mm，5m颗粒。分析柱为nanoACQUITY UPLC 超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱BEH C18，75m 250mm,1.7 m颗粒。柱温35C，流速200nl/min，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。梯度是 1%到40%B 80min，到80%B 10min，
17、80%B 停留10min，平衡20min到起始1%B。,质谱条件：Synapt High Definition Mass Spectrometry 质谱仪，离子化方式是纳升电喷雾正离子，DDA方式数据采集模式，每次扫描中两个强度最高的离子进行串联质谱分析。,图1 凝胶色谱图,表1 各馏分吸光度,图2 各馏分cTDA结果,图1是通过凝胶色谱在254nm波长下按照2mL为一单位分离出的馏分，但其峰面积的大小并不能真正反映出各馏分含肽量的高低，所以需要对各馏分进行含肽量的测定。选用紫外检测方法，在特定的波长下，各馏分吸光度的大小在一定程度上反映了各馏分中含肽量的高低，,由表1可知，两种测定方法基本达
18、到了一致效果，如吸光度较大的三组馏分(0.115和0.445)(0.102和0.413)(0.085和0.325)。此外，图2结果表明，馏分和的TDfactorMSG/TDfactorWater比值最大为16，说明这两组馏分鲜味较强，但是由于馏分最先由凝胶色谱分离出来，相对分子质量较大，可能含有蛋白或者其他大分子量的杂质，由此，选择馏分进行鲜味增强肽的鉴定。,筛选出的鲜味较强的馏分，经LC-MS/MS共鉴定出四条寡肽，分别为四肽：Asn-Pro-Gly-Va五肽：Gly-Ala-Ser-Ser-Thr七肽：Tyr-Glu-Asp-Val-Asp-Val-Lys十肽：Thr-Glu-Glu-Il
19、e-Ala-Pro-Gly-Thr-Pro-Ser。,表3和表4是各个肽-美拉德体系中产生的香味活性化合物的鉴定结果。结果显示，无论是四肽、五肽、七肽，还是十肽，当它们和木糖的热反应时，产物中都含有二甲基三硫化物、3,5-二甲基-1,2,4-三唑、5-甲基-2-苯基-2-己醛，而LA直接加热产物中则无，说明它们的生成与肽和木糖有关。,4.肽对香味活性化合物的影响,4.1 反应条件肽-美拉德反应体系组成如表3，反应温度120，时间90min，反应结束后迅速冷却至5060，倒于20mL玻璃瓶中，待测。,表2 肽-美拉德反应体系,4.2 GC-MS分析,气相条件：DB-WAX毛细管柱（30m0.25
20、0mm0.25m)，载气为氦气(纯度99.99%)，恒定流速为1.2 mL/min，分流比10：1，进样口250。柱温箱升温程序为：初始温度40，保持3 min，以5/min升温到200，保持0min，再以15/min升温到260，保持3 min。,质谱条件：质谱接口280，电离方式为EI，电子能量为70eV，离子源230，四级杆温度为150，溶剂延迟3min，质谱扫描范围40600aum。,表3 肽-美拉德反应测定结果1,表4 肽-美拉德反应测定结果2,表3和表4是各个肽-美拉德体系中产生的香味活性化合物的鉴定结果。结果显示，无论是四肽、五肽、七肽，还是十肽，当它们和木糖的热反应时，产物中都含有二甲基三硫化物、3,5-二甲基-1,2,4-三唑、5-甲基-2-苯基-2-己醛，而LA直接加热产物中则无，说明它们的生成与肽和木糖有关。,另外，与肽+LA体系、肽+木糖+LA体系相比，肽+木糖热反应产物中糠醛含量明显较高，几乎是40200倍，这也对热反应热感官结果中烟熏味较重有着很大的关系。与其他反应体系相比，2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-甲基-2-噻吩糠醛的生成与这四条肽及木糖可能无关或者关系不大。,
