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1、1,第二节 分子杂交及相关技术,分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。,2,双链probe或DNA解链，主要取决于：1链的长度：链越长，需要的 能量多才能解链；2碱基成分：GC含量高，较难变性；3化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链,3,一、杂交探针的获得,是指一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。Probe可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。,
2、4,（一）制备特异性探针所需要的基本条件,1.被检基因结构清楚；2.有明确的基因产物;3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。,5,（二）特异探针的来源,1、基因组探针：从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。克隆 扩增 大量的DNA探针,6,DNA克隆,7,2、cDNA probe:从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。,8,3、寡核苷酸探针,克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。,根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段。一般长约1550个bp。多数探针的制备都通过
3、分子克隆的方法获得。,9,二、探针的标记,将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的标识物：同位素：32P,35S,3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。常用的标记方法：,10,1、缺口平移法（Nick Translation）,原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口处按5 3方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性，在缺口处3端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。,
4、11,Nick Translation,OH,p,OH+,P,P,DNA,dNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I,32P-dNTP Bio-dNTP,12,2、随机引物法（6核苷酸引物标记法）,原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5 3聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3端为起点，沿模板3 5方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。,13,随机引物标记探针,5,3,5,5,3,DNA,32p-dNTP,Bio-D
5、ntp6bp primer,Klenow,dNTP变性-复姓,14,一、DNA杂交常用的方法,（一）.Southern blot 1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。1、原理和步骤:提取T、Cell DNA 限制酶消化 DNA片段 电泳分离 变性转移至尼龙膜 变性、杂交 洗膜、放射自显影、结果分析,15,Southern Blot,16,2、应 用:,(1)基因组结构分析：如缺失、插入、倒位等的检测(2)RFLP连锁分析,17,(二).斑点杂交(dot and slot hybridization),鉴定核酸序列的简便方法。1、原理及步骤：
6、提取T、Cell DNA 点样品至膜、干燥、固定 探针、DNA变性、杂交 洗膜、放射自显影 结果分析,18,DNA 样品,2、应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析,点样,Probe-32P,检测,AB,1 2 3 4,19,（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，ASO）,该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可以合成ASO探针。探针通常为20bp左右，标记后用于杂交检测。检测点突变时一般需合成两种探针：设计：正常探针 5-AGT-3 与正常基因序列杂交 稳定而不与突变基因杂交；突变探针 5-AAT-3 与突变基因序列杂交 稳定而不与正常基因杂交；PCR技术可结合
7、ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测扩增后的产物突变基因检测。,20,例:PKU产前诊断,正常探针,突变探针,1,2,1,2,2进行产前基因诊断结果分析2为正常个体,21,四、Northern blot,是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基 因探针分析基因的转录水平。1、原理及步骤：提取 T、Cell 总 RNA 提纯分离mRNA 琼脂糖凝胶电泳分离RNA 转移至硝酸纤维素膜 杂交检测,22,Norther Blot,23,2、应 用：,（1）.检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；（2）.mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）,24,五、Western blot,是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。原理及步骤：T or cell 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白（SDS-PAGE）转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质,25,West Blot,
