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1、实验一 普通光学显微镜的构造、使用方法-染色体、核仁组织区、染色体带型标本的观察,【实验目的】,1.了解普通光学显微镜的结构、原理。2.掌握普通光学显微镜的使用方法。3.了解染色体、核仁组织区、染色体带型标本制备的原理。4.掌握人类染色体、核仁组织区、染色体带型的特征。,【实验原理】,显微镜的主要部分是目镜和物镜，为两组凸透镜。物镜的焦距短，目镜的焦距较长。当被观察物体AB放在物镜前方的12倍焦距之间，光线通过物镜在镜筒中形成一个倒立的放大实像AB，这个实像恰好位于目镜的焦平面之内，通过目镜后形成一个放大的倒立虚像AB。通过调焦装置使AB落在人眼睛的明视距离（25mm）内，眼睛看到的物体最清晰
2、。AB的视角比眼睛直接看AB的视角大得多，因此我们可以用显微镜看清非常微小的物体。,普通光学显微镜成像原理图,显微镜的分类 现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学显微镜。这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型。,普通光学显微镜的基本结构,普通光学显微镜的构造可分为两部分：一为机械装置，二为光学系统。机械装置由镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗调节螺旋和微调节螺旋等部件组成。光学系统由目镜、物镜、聚光器、光源、滤光片、光圈等组成。,普通光学显微镜基本构造,显微镜的光路,光源光圈聚光镜通光孔标本（一定要透明）物镜镜筒目镜眼。,1.取镜和安放 置显微镜于平稳的实验台上
3、，镜座距实验台边沿约为34cm。镜检者姿势要端正。（取、放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或纪录。）,显微镜的使用,2.低倍镜的操作置显微镜于固定的桌上，接通电源，打开光源。将标本片放在载物台上，用标本夹夹住，调节推动器，使观察的目的物处于物镜的正下方。调节粗调螺旋，使物镜（10）与标本靠近，眼睛在侧向注视物镜，防止物镜和载玻片相碰。张开双眼向物镜里观察，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细准焦螺旋，至目的物清晰为止。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各
4、部分，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。,3.高倍镜的操作使用高倍镜前，必须先用低倍镜观察，发现目的物后将它移至视野正中处。旋动转换器换高倍镜。如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，这说明原来低倍镜并没有调准，目的物并没有真正找到，必须用低倍镜重新调节。如果高倍镜下观察目的物有点模糊，调节细准焦螺旋，直到视野清晰。调节细准焦螺旋时要注意旋转方向与载物台上升或下降的关系，防止镜头与载玻片强力接触，损坏镜头或载玻片。,4.油镜的操作如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。在载玻片上滴一滴香柏油，将油镜移至正中，缓慢调节粗调螺旋使油镜头浸没
5、在油中，刚好贴近载玻片。然后再用细准焦螺旋微微向上调（切忌不用粗准焦螺旋）即可。油镜观察完毕，用油镜纸将镜头上的油揩净，另用擦镜纸蘸少许二甲苯揩拭镜头，再用擦镜纸揩干。（应特别注意不要在下降镜头时用力过猛，或者调焦时误将粗调节螺旋向反方向转动而损坏镜头及载玻片）,5.换片 观察完一个标本后，如果想要再观察另一标本时，需先将高倍物镜（或油镜）转回到低倍物镜，取出标本，按放片的方法换上新片，即可观察。千万不可在高倍物镜（或油镜）下换片，以防损坏镜头。6 显微镜使用后的整理 观察结束后，调节光源到最小再关掉电源开关。调节粗调螺旋，使载物台下降到最低，取下玻片，擦干净镜体，罩上防尘罩，然后放回原处。,
6、显微镜的保养及注意事项,（1）油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再取一张擦镜纸，滴上少量的二甲苯擦拭，然后再取另一张新擦镜纸将镜头上残留的二甲苯擦净。否则粘固透镜的胶质会被二甲苯溶解，日久镜片易移位脱落。（2）下降聚光器，打开光圈，使反光镜垂直于镜座，以免积聚灰尘。（3）用绸布将镜身擦拭干净（切不可用手擦拭），除去灰尘、油污、水汽，以免生锈长霉。,（4）使显微镜的各部件恢复回原位，下降镜筒，使物镜呈“八”字形置于载物台上，然后将显微镜送回镜箱中。（5）显微镜应存放在干燥阴凉的地方，不要放在强烈的日光下暴晒，霉雨季节应在显微镜箱内放置干燥剂（硅胶），如长时间不用，则光学部分应卸下放在干燥器
7、中，以免受潮生霉。（6）显微镜应严禁与挥发性药品或腐蚀性药品放在一起，如碘片、盐酸、硫酸等药品。,操作练习,观察人染色体、核仁组织区、染色体带型切片。先在低倍镜下观察，选择染色体分散良好，无重叠的分裂中期细胞（此时已看不到细胞膜与核膜）。然后转至高倍镜下仔细观察分析，最后换油镜观察。首先计数该细胞染色体总数，再注意观察染色体的形态大小，每条染色体含有两条染色单体，两染色单体连接处为着丝粒，注意每条染色体的大小和着丝粒的位置。区分中央着丝粒染色体、亚中央着丝粒染色体、亚端着丝粒染色体和端着丝粒染色体。观察核仁组织区在染色体上的位置，在染色体组中的分布。观察染色体带型特征。,向培养物中加入适量的秋
8、水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。核仁组织区（NOR）就是染色体上编码5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA的基因（rDNA）所在的部位。染色质上具有转录活性或已转录过的rRNA基因部位伴有丰富的酸性蛋白，含有SH基团和二硫键，可将AgNO3中的Ag+还原成黑色的Ag颗粒，银染强度与rRNA的转录活性有关。,G-显带：Giemsa染料使染色体的不同区段出现亮暗相间带纹。DNA上含高比例二硫键的氧化态蛋白质
9、区域，经过一系列处理后显示暗带，而另一些含巯基的还原态蛋白质区域，为亲水性蛋白质，对染料的亲和力低，所以不易显色，为明带区。,人类染色体,人类染色体,人类染色体,染色体带型图谱,secondary constriction(次缢痕)：染色体上除主缢痕外的缢缩部位。Nucleolar organizing region(NOR,核仁组织区)：细胞核特定染色体的次缢痕处，含有rRNA基因的一段染色体区域，与核仁的形成有关。satellite(随体)：位于染色体末端、圆形或圆柱形的染色体片段，通过次缢痕与染色体的主要部分相连。,Telomere(端粒),Functions:For the compl
10、ete replication of chromosomeProtect the chromosomes from nuclease influencePrevent the ends of chromosomes from fusing,Human mitotic chromosomes and karyotype(核型)and banding pattern(带型),Chromosome painting=multicolor FISH,实验报告格式,一、实验项目名称二、实验目的三、实验原理四、主要仪器设备及耗材五、实验步骤六、实验数据及处理结果七、思考讨论题或体会或对改进实验的建议,显微
11、结构图的绘制,生物绘图中绘出的图要清楚，并正确的表示出形态构造的特点，绘图注意事项如下：(1)绘图要用黑色硬铅笔，不要用软铅笔或有色铅笔，一般用 2H 铅笔为宜。(2)图的大小及在纸上分布的位置要适当。一般画在靠近中央稍偏左方，并向右方引出注明各部名称的线条。各引出线条要整齐平列，各部名称写在线条右边。图的下方写图的名称及放大倍数（目镜倍数物镜倍数）。,【作业】,1绘制中期人染色体图，显示染色体的大小、数目和形态。2记录染色体总数，具有核仁组织区的染色体数。3说明G-显带原理。4概述显微镜使用的注意事项。,(3)画图时先用轻淡小点或轻线条画出轮廓，再依照轮廓一笔画出与物象相符的线条。线条要清晰，比例要准确。较长的线条要向顺手的方向运笔，或把纸转动再画。同一线条粗细相同，中间不要有断线或开叉痕迹，线条也不要涂抹。(4)绘出的图要正确，观察时要把混杂物、破损、重叠等现象区别清楚，不要把这些现象绘上。(5)图的明暗及浓淡，应用细点表示，不要采用涂抹方法。点细点时，要点成圆点，不要点成小撇。(6)整个图要美观、整洁，还要特别注意准确性。,
