第四章生物产品代谢调控发酵机制课件.ppt

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1、第四章 生物产品代谢调控发酵机制,1,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,本章主要内容：,氨基酸代谢调控机制 核酸与核苷酸代谢调控机制 抗生素代谢调控机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,2,1 氨基酸代谢调控机制,代谢控制发酵是用遗传学或其他生物化学的方法，人为 地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，打破微 生物正常的代谢调节，使有用产物大量生成和积累。,氨基酸发酵和核酸发酵是典型的代谢控制发酵。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,3,谷氨酸与瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸同属于谷氨酸族氨基酸，其合成途径是首先由-酮戊二酸生成谷氨酸，再进一步合成鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸,一、谷氨酸、鸟氨酸、瓜氨

2、酸、精氨酸生物 合成途径及其代谢调节机制,葡萄糖 谷氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,4,谷氨酸属“非必需”氨基酸，是体内代谢的基本氨基酸之一。在谷氨酰胺合成酶催化下，能与氨反应生成谷氨酰胺由尿 排出，起到解除氨毒作用；它还参与脑内蛋白质和糖代谢，促进氧化过程，改善中枢 神经系统的功能；在体内它能转化为丙酮或葡萄糖，因而升高血糖，减少糖 原异生，从而减少脂肪分解，减少酮体。,1.谷氨酸族氨基酸生物合成途径及代谢调节机制,谷氨酸的功能,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,5,肝昏迷预防；防止癫痫；减轻酮尿症和酮血症；胃酸不足；一种脑营养剂；食品保鲜剂。,药物 保健品 食品,

3、L-谷氨酸的用途,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,6,HMP途径,谷氨酸代谢途径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,7,由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,8,EMP 途径 HMP 途径TCA 循环 DCA 循环 CO2 固定,由葡萄糖生成谷氨酸的总反应式：,C6H12O6+NH3+O2 C5H9O4N+CO2+3H2O,代谢途径：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,9,由二羧酸和三羧酸生成谷氨酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,10,研究证明：,谷氨酸生产菌种存在EMP途径的全部酶和HMP途径有关 的酶,TCA循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地生

4、成谷氨酸，其相应的酶与谷氨酸合成有关,以醋酸和乙醇为原料进行谷氨酸发酵时，DCA循环是C4 二羧酸的唯一补充来源；但是以葡萄糖为原料时，在谷 氨酸生成期此循环应关闭,谷氨酸菌存在CO2固定生成草酰乙酸的PEP羧化酶和苹果 酸酶，与谷氨酸得率正相关,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,11,大肠杆菌及枯草芽孢杆菌等从谷氨酸到精氨酸生物合成途径及调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,12,谷氨酸生产菌及酵母菌等从谷氨酸到精氨酸生物合成及代谢调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,13,在黄色短杆菌中谷氨酸、天冬氨酸生物合成的调节机制,2.谷氨酸代谢调节机制,谷氨酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶磷酸

5、烯醇丙酮酸羧化酶柠檬酸合成酶,NH4+,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,14,在微生物的代谢中，Glu比Asp优先合成；合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp；Asp过量时反馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。,NH4+的导入不仅仅证明Glu是氮素同化发酵，它还会抑制 Glu生成的逆反应，因此当NH4+存在时，葡萄糖的消耗速度 很快，Glu的生成很高；但是当生物素充足时，NH4+几乎 不影响糖代谢。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,15,Glu生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适 量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失 调使Glu得以积累。,生物素

6、贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易析出，而培 养基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不 积累Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,16,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,17,表面活性剂拮抗作用部位,油酸缺陷型遗传阻碍部位,糖质或醋酸为碳源的磷脂合成途径,甘油缺陷型的遗传阻碍部位,石蜡为碳源的磷脂合成途径,细菌细胞Glu排出控制机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,18,丧失或有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力，使-酮戊二酸不能继续氧化；CO2固定能力强，使四碳二羧酸全部由CO2固定反应提供，而不走

7、乙醛酸循环；谷氨酸脱氢酶的活力很强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和反馈阻遏，同时，NADPH2再氧化能力弱，这会使-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻；有过量的NH4+存在，-酮戊二酸经氧化还原共轭氨基化反应而生成谷氨酸却不形成蛋白质，从而分泌泄漏于菌体外；同时，谷氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。,3.谷氨酸高产菌模型特征,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,19,从前图还可以看出：生产菌株还应该具有生物素合成缺陷、油酸合成缺陷和甘油合成缺陷等特点。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,20,-生物素缺陷型-油酸缺陷型-甘油缺陷型-温度敏感缺陷型-其它缺陷型,当前Glu生产中

8、的几种缺陷型：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,21,谷氨酸味精工业生产,味精是Glu单钠盐，学名：-氨基戊二酸一钠，商品 中有一分子结晶水,COOHCNH2CH2CH2COOH,COONaH2OCNH2CH2CH2COOH,L-谷氨酸,L-谷氨酸钠（味精）,H,H,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,22,4.生产工艺流程：,淀粉 葡萄糖,糖蜜 稀释蜜,配 料 种子罐,发酵罐,玉米浆糖 蜜磷酸二氢钾硫酸镁,无菌空气,Fe2+、Mn2+,NH3,菌种,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,23,等电提取,中 和,除 铁,脱 色,浓缩、结晶,离 心,干 燥,味 精,发酵罐,Na2CO3,第四章 生物

9、产品代谢调控发酵机制,24,谷氨酸族氨基酸的生物合成，是由葡萄糖开始，经EMP途径、HMP途径、TCA循环、DCA循环和CO2固定等，首先合成谷氨酸，再从谷氨酸依次经鸟氨酸、瓜氨酸生物合成精氨酸。,谷氨酸 N-乙酰谷氨酸 鸟氨酸 瓜氨酸 精氨酸,Glu,Orn,Cit,Arg,5.鸟氨酸发酵机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,25,鸟氨酸发酵与瓜氨酸发酵的遗传缺陷位置(谷氨酸棒杆菌为生产菌),第四章 生物产品代谢调控发酵机制,26,选育瓜氨酸缺陷型（Cit）菌株，即丧失鸟氨酸转氨甲酰酶，解除精氨酸的反馈抑制；向发酵液中提供瓜氨酸或精氨酸（亚适量），缺陷型才能生长；在瓜氨酸缺陷型（Cit）的

10、基础上，再选育精氨酸结构类似物抗性突变株（如选育抗精氨酸氧肟酸ArgHx和抗D-精氨酸等），就能遗传性的解除精氨酸的反馈调节。,鸟氨酸生产菌选育模型,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,27,6.瓜氨酸生物合成与发酵机制（讨论）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,28,鸟氨酸发酵与瓜氨酸发酵的遗传缺陷位置(谷氨酸棒杆菌为生产菌),第四章 生物产品代谢调控发酵机制,29,精氨酸发酵不能用阻断代谢流和营养缺陷型来进行，而应用抗反馈调节突变株，选育抗L-精氨酸结构类似物突变株（如D-ArgR、ArgHx等），解除精氨酸自身调节，使精氨酸积累。,7.精氨酸生物合成与发酵机制,第四章 生物产品代谢调控发酵

11、机制,30,二、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸 生物合成途径与发酵机制,天冬氨酸Asp，C4H7O4N赖氨酸 Lys，C6H14O2N2苏氨酸 Thr，C4H9O3N蛋氨酸 Met，C5H11O2SN异亮氨酸 Ile，C6H13O2N,天冬氨酸与赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸同属于天冬氨酸族的氨基酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,31,HMP途径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,32,天冬氨酸激酶（AK）高丝氨酸脱氢酶（HD）二氢吡啶-2,6-二羧酸（DDP）合成酶高丝氨酸激酶 O-琥珀酰高丝氨酸转琥珀酰酶半胱氨酸脱硫化氢酶苏氨酸脱氨酶天冬氨酸半醛脱氨酶二氢吡啶-2,6-二羧酸（DDP）还原酶

12、,1.天冬氨酸族氨基酸的生物合成途径,葡萄糖四碳二羧酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,33,2.天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制,(1)大肠杆菌中天冬氨酸族氨基酸生物合成的调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,34,在黄色短杆菌中赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成的代谢调节,(2)谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等天冬氨酸族氨基酸的代谢调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,35,优先合成：葡萄糖经酵解途径生成PYR，PYR 经 CO2 固定和氧化脱羧进入TCA循环，生成草酰 乙酸，再经氨基化反应生成Asp；Met比Thr、Lys优先合成，Thr比Lys优先 合成。,天冬氨酸

13、激酶是关键酶，AK是变构酶，具有两个变构部 位，可以与终产物Lys和Thr结合，受终产物的反馈控制。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,36,在黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等微生物中，AK是单一的，并且受Lys 和 Thr的协同反馈抑制，反馈调节易于解除，使育种简单化，所以常常被用作氨基酸发酵育种的出发菌株。,黄色短杆菌的AK受Lys和Thr协同反馈情况,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,37,“代谢互锁”,乳糖发酵短杆菌中赖氨酸及其前体物生物合成的代谢调节,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,38,在黄色短杆菌中天冬氨酸与乙酰CoA形成的平衡合成,PC,平衡合成：Asp和乙酰CoA形成平衡合成，当

14、乙酰CoA合成过量时，能解除Asp对PEP羧化酶的反馈抑制。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,39,L-天冬氨酸是酸性氨基酸，属“非必需”氨基酸。可以作为K+、Mg2+离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用。参与鸟氨酸循环，促使氨和二氧化碳生成尿素，降低血液中氨和二氧化碳的量，增强肝脏功能，消除疲劳。新型甜味剂的原料。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,40,高产赖氨酸菌的遗传标记位置,3.赖氨酸发酵机制,（高丝氨酸脱氢酶缺失）,AK,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,41,1）切断或减弱支路代谢，选育高丝氨酸缺陷型（Ho

15、m）突变株，或蛋氨酸和苏氨酸或异亮氨酸缺陷型（Met+Thr、Ile）突变株；,2）解除Thr和Lys的协同反馈抑制作用，选育结构类似物抗性突变株，使赖氨酸大量积累，如：S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸抗性株（AECr）L-赖氨酸氧肟酸盐抗性株（LysHxr）苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株（ThrHxr）等；,3）增加Lys前体物Asp的量：切断生成丙酮酸的支路，同时解除Asp对PEP羧化酶（即PC）的反馈抑制；选育丙氨酸缺陷型（Ala）或温度敏感突变株（tmps），中断丙酮酸到Ala的反应；选育AspHxr、磺胺类药物抗性突变株；,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,42,赖氨酸发酵育种所使用的一

16、些结构类似物,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,43,4）在乳糖发酵短杆菌中，Lys的生物合成与亮氨酸（Leu）之 间存在着“代谢互锁”，即赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡 啶-2,6-二羧酸（DDP）合成酶受Leu的反馈阻遏（如图）,选育Leu+LeuHxr或Leu温度敏感突变株,乳酸发酵短杆菌中Lys与Leu生物合成间的相互关系,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,44,选择亮氨酸缺陷型菌株；选育抗亮氨酸结构类似物突变株；选育对苯醌或喹啉衍生物敏感株这是一种寻找 亮氨酸渗漏缺陷型菌株的育种方法。,为解除代谢互锁，可选育：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,45,选择丙氨酸缺陷型菌株；选育抗天冬氨

17、酸结构类似物突变株；选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比的菌株。,增加前体物的合成和阻塞副产物生成：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,46,添加丰富的生物素，既可以使Glu不排出体外，并使代谢 流转向Lys的合成，又能提高PEP羧化酶（PC）的活性，促使PEP生成草酰乙酸，再生成Asp。,选育温度敏感突变株：如，乳糖发酵短杆菌 AJ11093 AJ1099 在发酵前期于2933生长良好，而到34 以上时则不 能生长，发酵积累赖氨酸盐酸盐。,其它措施：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,47,；+：回复突变。,某些赖氨酸产生菌及其产酸能力,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,48,Lys的

18、结构类似物的作用：起到假反馈抑制作用。Lys的结构类似物的结构与Lys相似为AK所误认，与Thr一 起在AK的变构部位上结合，协同抑制酶的活性。但当Lys的结构类似物（AEC）单独存在时，对酶活性没有抑制作用。通过改变AK编码的结构基因，可以使AK对Lys及结构类 似物不敏感，即使在过量Thr存在时，该酶也不与Lys或结 构类似物结合，但酶的活性中心不变。（具有这一特性的 的菌株叫做抗结构类似物突变株或代谢调节突变株。）具有抗性并兼有营养缺陷型的菌株，Lys才能高产。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,49,赖氨酸工业化生产,赖氨酸，Lysine，化学名称 2,6-二氨基乙酸 化学组成 C6H

19、14O2N2,CH2NH2CH2CH2CH2CHNH2COOH,L-赖氨酸,Lys是人体必需的8种氨基酸之一 产量在氨基酸中占第三位，仅次 于谷氨酸和蛋氨酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,50,糖 蜜配 料灭 菌发酵罐,菌种斜面摇瓶种子 种子罐,压缩空气总过滤器分过滤器,N,P,K,Mg,提取、精制,Lys,Lys发酵工艺流程：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,51,温度：发酵前期 32 中后期 34 pH：6.57.5 种龄和接种量：二级种子接种量约 2%，种龄812h 三级种子 10%，628h 通风供氧：Lys的最大生成量是在供氧充足、细菌呼 吸充足的时候,第四章 生物产品代谢调控

20、发酵机制,52,生物素：要充足，2030g/L以上 维生素B1：有促进作用 醋酸：加入醋酸比单独采用糖质原料Lys产量高 硫酸铵：适当增加，4%4.5%Cu2+：一定浓度的CuSO45H2O，可提高产量 流加糖和其它生长因子,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,53,发酵液 菌体分离 上清液 离子交换 真空浓缩,离子分离 重结晶 粗结晶 离子分离 结晶,结晶 干燥 Lys成品,菌体 水洗 二次菌体分离 上清液,饲料 菌体,母液,二次母液,调pH，加入絮凝剂,Lys 提取与精制工艺：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,54,1）发酵液的处理：用草酸除去发酵液中的Ca3+，调节pH至232）菌体分离

21、：用碟片式自动卸渣高速离心机，分离菌体和草酸钙等3）离子交换吸附及洗脱：铵型阳离子交换树脂，洗脱剂为氨水加氯 化铵；用茚三酮检查流出液，pH9.512，得率可达90%95%4）真空浓缩：去除氨，并提高Lys含量，真空时温度65，浓度22 23B5）中和结晶：加入工业盐酸，搅拌，pH5.2，自然冷却结晶，至5结 晶完全（粗结晶，含一分子结晶水的粗L-Lys盐酸盐）6）重结晶：用蒸馏水溶解，1112B，加入活性炭脱色，压滤，再真空浓缩至22B，再结晶、冷却、离心分离并水洗7）干燥：60热风干燥，去结晶水，得到L-Lys盐酸盐，含水0.1%以下,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,55,4.苏氨酸高产

22、菌 的生化模型特 征（讨论）,异亮氨酸,反馈控制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,56,切断支路代谢，选育Met、Lys的突变株；选育抗Thr和Lys结构类似物的突变株，遗传性的解除Thr对高丝氨酸脱氢酶的反馈调节，以及遗传性的解除Thr、Lys对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制；切断Thr进一步代谢途径，选育Ile的突变株，或异亮氨酸渗漏突变株（IleL），或异亮氨酸缺陷回复突变株（Ile+）；增强Asp的生物合成。,苏氨酸高产菌的生化模型特征：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,57,利用现代生物技术选育苏氨酸生产菌,利用转导和原生质体转化法选育Thr生产菌,转导作用就是利用转导噬菌体为媒介，

23、将供体菌的部分基因导入到受体菌中从而使受体均获得供体菌的部分遗传性状的过程。,特点：过程容易；易获得优良性状；选育时间短。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,58,大肠杆菌中天冬氨酸族氨基酸生物合成的调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,59,大肠杆菌野生型B1,双缺突变株B2（TDH TD）,羟缬氨酸抗性标记B3,AK、HD反馈抑制脱敏株B4,AK、HD去阻遏突变株B5,AECr反馈抑制脱敏株B6,B7,B8,4种调节变异组合在一起的转导子B9,具有 6 种调节变异组合的转导子 B12,2次诱变,带上Thr,带上Thr,2次转导,导入解除AK和HD反馈阻遏的B10基因,导入解除AK和H

24、D反馈阻遏的B11基因,发酵Thr达40g/L,TDH Thr脱氢酶 TD Thr脱氨酶 AK Asp激酶 HD Hom脱氢酶,带上羟缬氨酸抗性标记,木柱等：利用转导和原生质体转化法选育Thr生产菌方法,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,60,利用原生质体融合技术选育Thr生产菌,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,61,利用基因工程技术构建Thr工程菌,利用重组DNA技术构建Thr工程菌株，即可采用简单的鸟枪法单克隆，也可采用整个Thr操纵子的体外诱变及体外重组。最基本的方法是：将Thr生物合成途径中起限速作用的限速酶AK和HD的基因连续在多拷贝的载体质粒上并克隆化，使该基因进行扩增，通过发挥

25、基因的基因扩增效应，排除生物合成中的“瓶颈”效应，从而使Thr产量得以大大提高。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,62,苏氨酸的生物合成及苏氨酸操纵子的结构,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,63,将Thr合成酶系HD基因、HK基因、thr合成基因组入L-Lys产生菌谷氨酸棒杆菌中，由积累L-Lys62g/L变成积累L-Thr51g/L。据田边制药公司报道，将改良后不再受反馈抑制的苏氨酸合成酶（AK、HD）基因导入改良型粘质沙雷氏菌（Serratiamar cescens），以蔗糖为碳源进行发酵，积累苏氨酸60mgml。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,64,高产蛋氨酸菌的遗传标记位置,解

26、除反馈抑制；切断支路代谢；切断Met向下反 应的通路；增加前体物的 合成。,5.蛋氨酸发酵机制（讨论）,（SAM）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,65,三、分支链氨基酸族氨基酸生物合成途径与缬 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸发酵机制,亮氨酸 Leu，C6H13O2N异亮氨酸 Ile，C6H13O2N缬氨酸 Val，C5H11O2N,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,66,1.分支链氨基酸族氨基酸生物合成途径和代谢调节机制,天冬氨酸,葡萄糖,生物合成途径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,67,分支链氨基酸族氨基酸生物合成途径调节,L-苏氨酸脱氨酶,L-苏氨酸,TD,AS,TDL-苏氨酸脱氨酶AS-

27、乙酰乳酸合成酶,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,68,1）分枝链氨基酸生物合成的优先顺序为：Ile、Leu、Val2）TD受Ile的强烈反馈抑制；3）AS受Val的反馈抑制；4）-异丙基苹果酸合成酶受Leu的反馈抑制；5）分枝链氨基酸合成酶系的各个酶的生成，受这三种末端 氨基酸Ile+Val+Leu的多价阻遏。,分枝链氨基酸生物合成途径和自我调节的特点：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,69,添加D-苏氨酸、-溴丁酸、-氨基丁酸等前提物，绕过反馈调节；添加的D-苏氨酸脱氢酶是诱导酶，不受反馈抑制，并选育Ile结构类似物抗性突变株，从而解除Ile对TD和对AS的反馈调节；由于添加D-苏氨酸，

28、则会使Ile、Val、Leu在菌体内的贮存平衡受到破坏，使Ile大量积累；注意控制培养基中Val和亚适量，并选育Leu突变株；增加前体物质的生成量。,2.异亮氨酸代谢调节的解除及育种途径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,70,切断支路代谢，选育IleLeu突变株；解除Ile、Val、Leu对合成酶系（AS）的多价阻遏（筛选结构类似物突变株）；解除Val对-乙酰乳酸合成酶的反馈抑制。Val生产菌的遗传标记：IleLeu-ABr2-TArCMr,（-氨基丁酸）,（2-噻唑丙氨酸）,3.缬 氨酸育种机制（讨论）,（“共系的生物合成途径”分别为共同的酶所催化）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,71

29、,首先必须解除Leu对-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制，选育抗Leu结构类似物(如2-TA)突变株；选育抗Val结构类似物(如2-AB)的突变株；切断支路代谢，选育Ile突变株。,4.亮氨酸发酵机制（讨论）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,72,四、芳香族氨基酸生物合成途径与色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的发酵机制,1.芳香族氨基酸生物合成途径,色氨酸 Trp苯丙氨酸 Phe酪氨酸 Tyr,分子中都含有苯环,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,73,1.芳香族氨基酸的生物合成途径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,74,从4-磷酸赤藓糖与磷酸烯醇丙酮酸合成3-脱氧-D-阿拉伯糖型庚酮糖-7-磷酸（DA

30、HP）到分支酸，是Phe、Tyr和Trp的共同途径；从分支酸到预苯酸（PPA），是Phe和Tyr的共同途径；在分枝酸处，倾向于优先合成氨茴酸；在预苯酸处，倾向于优先合成对羟苯丙酮酸。即优先合成顺序是：Trp-Tyr-Phe。,合成途径特点：,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,75,大肠杆菌中有三种DAHP合成酶,谷氨酸棒杆菌中，在芳香族氨基酸生物合成途径中受调节控制的关键酶：DAHP合成酶（DS）、分枝酸变位酶（CM）、预苯酸脱氢酶（PD）、预苯酸脱水酶（PT）和氨茴酸合成酶（AS）,黄色短杆菌中有一种DAHP合成酶，代谢调节较易控制,2.芳香族氨基酸的代谢调控机制,第四章 生物产品代谢调控发

31、酵机制,76,大肠杆菌中芳香族氨基酸生物合成途径与代谢控制,DAHP合成酶分支酸变位酶PPA脱氢酶PPA脱水酶氨茴酸合成酶,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,77,在黄色短杆菌中芳香族氨基酸生物合成的调节机制,DSDAHP合成酶CM分支酸变位酶PD预苯酸脱氢酶PT预苯酸脱水酶AS氨茴酸合成酶,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,78,色氨酸生产菌的遗传标记位置,3.色氨酸发酵机制（讨论）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,79,色氨酸代谢调控机制（大量生成和积累色氨酸）：,切断支路代谢，选育苯丙氨酸和酪氨酸双重缺陷型（phe-+tyr-）的突变株；然后遗传性的解除色氨酸自身的反馈抑制和阻遏及苯丙

32、氨酸、酪氨酸和色氨酸对DAHP合成酶的反馈调节；选育色氨酸多重结构类似物抗性突变株；在发酵过程中限量添加苯丙氨酸和酪氨酸。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,80,苯丙氨酸生产菌的遗传标记位置,4.苯丙氨酸和酪氨酸发酵机制（讨论）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,81,苯丙氨酸代谢调控机制：,首先切断芳香族氨基酸生物合成向酪氨酸和色氨酸的代谢支路，选育色氨酸和酪氨酸双重缺陷型（tyr-+trp-）突变株；然后遗传性的解除苯丙氨酸自身对预苯酸脱水酶和分支酸变位酶的反馈抑制和阻遏，及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸对DAHP合成酶的反馈调节；选育苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸多重结构类似物抗性突变株；发酵中限

33、量添加酪氨酸和色氨酸，使苯丙氨酸大量积累。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,82,2 核酸类物质的代谢调控机制,一、核苷酸的生物合成途径,核酸发酵是在氨基酸发酵基础上的 进一步深化和发展 的代谢控制发酵,1.嘌呤核苷酸的全合成途径（“从无到有”途径）,IMP肌苷酸 SAICAR5-氨基-(N-琥珀基)代氨甲 AMP腺苷酸 酰咪唑核苷酸 GMP鸟苷酸 AICAR5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸 XMP黄苷酸 PRPP磷酸核糖焦磷酸 SAMP腺苷琥珀酸 PRA5-磷酸核糖胺,（次黄嘌呤核苷一磷酸）,（腺嘌呤核苷一磷酸）,（黄嘌呤核苷一磷酸）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,83,嘌呤核苷酸的全合

34、成途径(1)5-IMP的生成（“从无到有”）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,84,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,85,嘌呤核苷酸的全合成途径(2)AMP和GMP的互变,（枯草芽孢杆菌）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,86,各种微生物合成IMP的途径是一样的,但是从IMP分别生成AMP和GMP的途径是不同的。,从IMP开始，枯草杆菌以IMP为中心分出两条环形路线，由此AMP与GMP可以互相转换；产黄短杆菌分出的两条路线不是环形，而是单项分枝的，AMP与GMP不能互相转换,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,87,枯草杆菌的嘌呤核苷酸生物合成途径,葡萄糖5-磷酸核糖,（磷酸核糖焦磷酸）,

35、（5-磷酸核糖胺）,（5-胺基-4-（N-琥珀基）代氨甲酰咪唑核苷酸）,（5-胺基-4-氨甲酰咪唑核苷酸）,肌苷酸,黄苷酸,鸟苷酸,腺苷酸,琥珀酰腺苷酸,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,88,产黄短杆菌的嘌呤核苷酸生物合成途径,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,89,2.嘧啶核苷酸的全合成途径（略）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,90,3.核苷酸生物合成的补救途径,当全合成受阻时，微生物可从培养基中取得完整的嘌呤或嘧啶，和戊糖、磷酸通过酶的作用直接合成单核苷酸所以称为“补救途径”。,嘌呤碱基、核苷和核苷酸之间能通过分段合成互相转变,其中最重要的反应是：碱基+PRPP 5-核苷酸+PPi,

36、核苷酸焦磷酸化酶,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,91,嘌呤核苷酸的补救合成途径 嘌呤碱基、核苷和核苷酸的相互转换,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,92,IMP合成系的代谢控制及嘌呤核苷酸互变的代谢控制,二、嘌呤核苷酸的代谢调节机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,93,嘌呤核苷酸可以分为GMP、IMP等6-羟基嘌呤核苷酸与ADP、AMP等的6-氨基嘌呤核苷酸两类。如果同时添加这两类嘌呤核苷酸（GMP+AMP 或IMP+ADP），抑制作用就会相乘的提高，这种现象叫做“合作终产物抑制”。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,94,嘌呤核苷酸相互转换系的代谢控制,调节位点,A,PR-ATP 1

37、-（5-磷酸核糖基）-三磷酸腺苷,AMP脱氨酶,SAMP裂解酶,SAMP合成酶,XMP氨化酶,GMP还原酶,IMP脱氢酶,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,95,以IMP为中心的两个循环，各个反应是不可逆的,IMP脱氢酶受GMP的反馈抑制，也被GMP阻遏；GMP还原酶受ATP的反馈抑制。同样的，AMP抑制SAMP合成酶，GTP抑制AMP脱氨酶,SAMPAMP反应的供能体为GTP，XMPGMP反应的供能体为ATP,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,96,根据上述调节机制，当细胞中的GMP水平提高到一定程度时，从IMP的代谢流就自动地转向AMP方面；反之，当细胞的AM水平高到一定程度时，从IMP的

38、代谢流就自动地转向GMP方面。,另一方面，核苷酸的代谢也与组氨酸的生物合成有关：AICARIMPAMPATPPR-ATPAICAR形成一个循环，由PRATP经咪唑甘油磷酸生成组氨酸。假入组氨酸过剩，则不走此途径。,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,97,三、肌苷和肌苷酸高产菌的选育模型,1）切断两条支路代谢，选育腺嘌呤缺陷型（Ade）和黄 嘌呤缺陷型（Xan）的双重缺陷型突变株；2）通过限量腺嘌呤和鸟嘌呤来解除腺嘌呤系和鸟嘌呤系 化合物对IMP生物合成的酶的反馈抑制；3）进一步选育抗腺嘌呤、鸟嘌呤类似物和（或）抗磺胺 剂突变株，从遗传上解除正常代谢控制；（选育抗性突变株时，应采用丧失腺嘌呤脱氢

39、酶（dea）的菌株为出发菌株）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,98,4）选育Mn2+脱敏突变株（MnINS），或控制培养基中Mn2+的浓度，解除细胞膜渗透型障碍。5）生产肌苷时，肌苷酸酶活性要强，而肌苷酸化酶要越弱越好，以使生成的肌苷不再分解。模型：Ade+Xa+dea+GMPred+8AGr（或8AXr、ARr）+SGr+NP+ARr+Smr（符号见微生物工程工艺原理p.116）,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,99,5-IMP发酵应具备的条件：选择肌苷酸酶弱或丧失的出发菌株；切断IMP向下的两条支路，使IMP大量生成和积累；选育结构类似物双重抗性突变株；限量添加Mn2+，解除细胞膜渗

40、透型障碍。,肌苷酸发酵机制,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,100,鸟苷酸发酵机制(讨论),第四章 生物产品代谢调控发酵机制,101,END,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,102,我劝一个草率结婚的朋友离婚。她平静的告诉我，如果说当初鲁莽结婚是个错误。那么，现在草率离婚是一错再错。这位朋友后来还是离婚了，大家一致认为她的行为很理性。同样的故事正在互联网搜索巨头谷歌身上发生，但是谷歌选择了草率“离婚”。饮鸩止渴由于急于抑制苹果iphone手机翻天覆地的产业冲击，谷歌采取急功近利的粗糙型开放策略。饮鸩止渴的策略一时取得了成果。市场研究公司尼尔森最近公布的数据显示，在通过Verizon Wir

41、eless、AT&T和Sprint Nextel三大运营商经销后，谷歌Android手机在美国市场上的销售量已经超过iPhone。另一家市场研究公司iSuppli甚至认为，全球范围内使用Android操作系统的手机数量将在 2012年超过苹果iPhone。表面繁华的背后，是Android生态系统的一团糟，谷歌正在为自己的粗放型开放策略买单。用户对谷歌手机的态度从开始的好奇、后来的犹豫，变成强烈的批评。“大多Android手机程序都是垃圾，乱七八糟的”，一位手机发烧友迅速投奔了iphone的阵营：“同样的植物人大战僵尸游戏，在谷歌手机和iphone手机上的体验简直没法比”混乱，还是混乱。一切一切

42、的乱象，折射出谷歌已经失去对Android生态系统的控制。这一切的根源，我的判断是开放策略初期过于宽松，导致失去控制权。混乱的生态系统表现在用户手机上，就是应用程序的混乱和粗燥。一错再错为此，谷歌开始采取对策。最近，有国内厂商称新的Android3.0开始关闭应用程序的API(应用程序编程接口)，统一Android界面。这意味着，谷歌将放弃其初始开放策略，开始封闭管理。粗看之下，谷歌认识到自己的错误。既然是过度开放导致的错误，那么收紧开放尺度是很自然的逻辑，无懈可击。但我认为，谷歌仓促收紧开放策略仍然是个错误。打个比喻。如果过度开放的政策是草率结婚，那么草率的封闭就是草率离婚。这么判断的原因很

43、简单，谷歌把Android开放出去的那一天，Android已经不属于谷歌。谷歌没有认识到这一点，还以为Android只是自己的。合作伙伴对谷歌封闭政策的反应加强了我的判断结论。经济观察报报道，国内第一家生产基于Android平台手机的设计公司创杨通信，近日已经被迫出售。创杨通信负责人给出的出售理由是，“因为不愿意甘当炮灰而选择放弃。”按照目前Android3.0将统一界面的想法，未来的手机市场将出现毫无差异化的产品。这对于企业来说，几乎意味着不可避免的价格战。利润空间的微薄，导致合作伙伴生存环境恶劣。于是大量退出几乎是一种必然。除了为合作伙伴找到新的利益空间，谷歌还将面临开放阵营精神层面的声讨

44、，这对谷歌的挑战会更大。如果说谷歌为了自己竞争的私利利用了开放，赢得了名声。那么，谷歌不能一脚把开放踢开，他现在还需要为这种名声买单。如果只顾自己收网，谷歌会被面临铺天盖地的道德谴责。谷歌，希望你准备好了，三思而行。木桶效应就是指一个水桶无论有多高，它盛水的高度取决于其中最低的那块木板。这在选购手机的时候也同样适用。尤其是很多用户在购买手机的时候，都会专注于某一个参数，比如要求处理器主频要高达1GHz，但一部手机的整机表现是由多个因素组成，所以在购买手机的时候一定要从整体的角度上来看一部手 机的性除了处理器主频以外，其实还有很多影响整机表现的元素，比如运行内存(RAM)、机身内存(ROM)、操

45、作系统、厂商对系统的优化都会有所影 响。不过在很多用户眼中，这几项却远没有处理器主频重要。而如果忽略这几项的话，可能买到一个主频很高，但整机性能却仍然不令人满意的机型。用户在选机过程中切勿只关注一个硬件参数，这样很可能并不能买到一款理想的机型，就算买的手机主频再高，运行内存低的话仍然无法同时运行数个程 序、机身内存小的话则无法把太多的软件安装到机器上，这对整机耗电和运行速度方面都有所影响、而厂商优化更是决定着一部手机的稳定性和部分运行速度。综上 所述，大家在选购手机的时候一定要综合考虑一款手机的硬件规格。除此之外，也不要把硬件看的太过重要，就比如苹果iPhone 3GS在硬件配置上并不出众，但

46、却在操控手感以及软件资源上目前难有机型企及。更高分辨率能获得更为逼真细腻的显示效果，所以对于屏幕的分辨率绝大多数人都会偏向于分辨率更高的机型。但对于笔者 所说的高分辨率未必是好事会有所怀疑。其实这里说的高分辨率“不好”更多是指采用非主流的高分辨率机型。在此前，就有几款“悲情”机型在分辨率上吃了不小 的亏。大名鼎鼎的HTC Diamond就是一款颇具代表意义的机型，Diamond上市的手机市场还处于QVGA时代、只有少数旗舰机皇采用WVGA这样级别的屏幕，由于HTC Diamond却采用了VGA这一过渡型的分辨率，而也正是因为这一点，Diamond很多软件都未有支持或无法完美运行，可谓是一个不小

47、的遗憾。除此之 外，曾经非常经典的,第四章 生物产品代谢调控发酵机制,103,附赠人生心语人生太短，聪明太晚人生太短，聪明太晚(1)我们都老得太快却聪明得太迟把钱省下来，等待退休后再去享受结果退休后，因为年纪大，身体差，行动不方便，哪里也去不成。钱存下来等养老，结果孩子长大了，要出国留学，要创业做生意，要花钱娶老婆，自己的退休金都被拗走了。人生太短，聪明太晚(2)当自己有足够的能力善待自己时，就立刻去做，老年人有时候是无法做中年人或是青少年人可以做的事，年纪和健康就是一大因素。小孩子从小就告诉他，养你到高中，大学以后就要自立更生，要留学，创业，娶老婆，自己想办法，自己要留多一点钱，不要为了小孩

48、子而活我们都老得太快却聪明得太迟，我的学长去年丧妻。这突如其来的事故，实在叫人难以接受，但是死亡的到来不总是如此。学长说他太太最希望他能送鲜花给他，但是他觉得太浪费，总推说等到下次再买，结果却是在她死后，用鲜花布置她的灵堂。这不是太蠢愚了吗？！等到.、等到.，似乎我们所有的生命，都用在等待。人生太短，聪明太晚(3)等到我大学毕业以后，我就会如何如何我们对自己说等到我买房子以后！等我最小的孩子结婚之后！等我把这笔生意谈成之后！等到我死了以后人人都很愿意牺牲当下，去换取未知的等待；牺牲今生今世的辛苦钱，去购买后世的安逸在台湾只要往有山的道路上走一走，就随处都可看到农舍变精舍，山坡地变灵塔，无非也是

49、为了等到死后，能图个保障，不必再受苦。许多人认为必须等到某时或某事完成之后再采取行动。明天我就开始运动，明天我就会对他好一点，下星期我们就找时间出去走走；退休后，我们就要好好享受一下。人生太短，聪明太晚(4)然而，生活总是一直变动，环境总是不可预知，现实生活中，各种突发状况总是层出不穷。身为一个医生，我所见过的死人，比一般人要来得多。这些人早上醒来时，原本预期过的是另一个平凡无奇的日子，没想到一个意料之外的事；交通意外、脑溢血、心脏病发作等等。剎那间生命的巨轮倾覆离轨，突然闯进一片黑暗之中。那么我们要如何面对生命呢？我们毋需等到生活完美无瑕，也毋需等到一切都平稳，想做什么，现在就可以开始做起。

50、一个人永远也无法预料未来，所以不要延缓想过的生活，不要吝于表达心中的话，因为生命只在一瞬间。人生太短，聪明太晚(5)记住！给活人送一朵鲜花，强过给死人送贵重的花圈，每个人的生命都有尽头，许多人经常在生命即将结束时，才发现自己还有很多事没有做，有许多话来不及说，这实在是人生最大的遗憾。别让自己徒留为时已晚的空余恨。逝者不可追，来者犹未卜，最珍贵、最需要实时掌握的当下，往往在这两者蹉跎间，转眼错失。人生太短，聪明太晚(6)人生短暂飘忽，包得有一首小诗这样写：高天与原地，悠悠人生路；行行向何方，转眼即长暮。正是道尽了人生如寄，转眼即逝的惶恐。有许多事，在你还不懂得珍惜之前已成旧事；有许多人，在你还来