微生物限度检查法汇总.doc

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1、微生物限度检查法1范围本标准适用于非规定灭菌制剂及其原料、辅料检查项目包括细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌检查及活螨的检查。2依据标准中华人民共和国药典药品微生物学检验手册YBB00132002药品包装用复合膜、袋通则3 人员资质及培训3.1 从事药品微生物检验工作的负责人应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。3.2 检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认可以承担某一试验前，不能独立从事该项微生物试验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别实验人员的继续教育计划。3.3 检验人

2、员必须熟悉相关检验方法、程序、检测目的和结果评价。3.4 实验室应通过参加内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法客观评价检验人员的能力，必要时对其进行再培训并重新评估。当使用一种非经常使用的方法或技术时，有必要在检测前确认微生物检测人员的操作技能。 4 培养基4.1 培养基的制备4.1.1 培养基可按处方配制。也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。4.1.2 在制备培养基时，应选择质量符合要求的脱水培养基或单独配方组分进行配制。脱水培养基应附有处方和使用说明，配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求，不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。4.1.3 脱水培养基或单独配

3、方组分应在适当的条件下贮藏，如低温、干燥和避光，所有的容器应密闭，尤其是盛放脱水培养基的容器。商品化的成品培养基除了应附有处方和使用说明外，还应注明有效期、贮藏条件、适用性检查试验的质控菌和用途。4.1.4 为保证培养基质量的稳定可靠，各脱水培养基或各配方组分应准确称量，并要求有一定的精确度。配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下，可能需要去离子水和蒸馏水。应记录各称量物的重量和水的使用量。4.1.5 配制培养基所用容器和配套器具应洁净，可用纯化水冲洗玻璃器皿以消除清洁剂和外来物质的残留。对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器一般应预先进行灭菌，以保证培养基的无菌性。4.1.6 脱水培养

4、基应完全溶解于水中，再进行分装和灭菌。配制时若需要加热助溶，应注意不要过度加热，以避免培养基颜色变深。如需要添加其它组分时，加入后应充分混匀。4.1.7 应按照生产商提供或使用者验证的参数进行培养基的灭菌。培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术，特殊培养基可采用薄膜过滤法除菌。培养基灭菌程序应采用验证的灭菌程序灭菌，培养基灭菌方法和条件，应通过无菌性和促生长试验进行验证。此外，对高压灭菌器的蒸汽循环系统也要加以验证，以保证在一定装载方式下的正常热分布，温度缓慢上升的高压灭菌器可能导致培养基的过热，过度灭菌可能会破坏大多数的细菌和真菌培养基促生长的质量。灭菌器中培养基的容积和装载方式也将影响加热的速度。

5、因此，应根据灭菌培养基的特性，进行全面的灭菌程序验证。4.1.8 应确定每批培养基灭菌后的pH值（冷却至室温25测定）。若培养基处方中未列出pH值的范围，除非经验证表明培养基的pH值允许的变化范围很宽，否则，pH值的范围不能超过规定值0.2。4.1.9 制成平板或分装于试管的培养基应进行下列检查：容器和盖子不得破裂，装量应相同，尽量避免形成气泡，固体培养基表面不得产生裂缝和涟漪，在冷藏温度下不得形成结晶，不得污染微生物等。应记录批数量、有效期，并进行培养基的无菌检查。4.2 培养基的贮藏4.2.1 自制的培养基应标记名称、批号、配置日期等信息，并在已验证的条件下贮藏。商品化的成品培养基标签上应

6、标有名称、批号、生产日期、失效期及培养基的有关特性，生产商和使用者应根据培养基使用说明书上的要求进行贮藏，所使用的贮藏和运输条件应使成品培养基最低限度的失去水分并提供机械保护。4.2.2 培养基应避光保存，若要长期保存，应置于密闭容器中以防止水分流失。琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，一般不超过1周，且应密闭包装，若延长保存限期，保存期需经验证确定。4.2.3 固体培养基灭菌后的再融化只允许1次，以避免因过度受热造成培养基质量下降或微生物污染。培养基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加热。若使用微波炉，应避免培养基过度受热及水分的蒸发，更要注意安全。融化的培养基应置4550的水浴中，不得超过8小

7、时。倾注培养基时，应擦干培养基容器外表面的水分，避免容器外壁的水滴进行培养基中造成污染。4.2.4 使用过的培养基（包括失效的培养基）应与未使用的培养基分开摆放，并按照规定程序及时进行处理。4.3 培养基的质量控制试验4.3.1 所有配制好的培养基均应进行质量控制试验。实验室配制的培养基的常规监控项目是pH、适用性检查试验，定期的稳定性检查以确定有效期。培养基在有效期内应依据适用性检查试验确定培养基质量是否符合要求。有效期的长短将取决于在一定存放条件下（包括容器特性及密闭性）的培养基其组分的稳定性。4.3.2 除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一

8、批脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基培养基均要进行适用性检查试验，试验的菌种可根据培养基的用途从相关附录中进行选择，也可增加从生产环境及产品中常见的污染菌株。4.3.3 培养基的质量控制试验若不符合规定，应寻找不合格的原因，以防止问题重复出现。任何不符合要求的培养基均不能使用。5 菌种5.1 药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。5.2 标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培

9、养基生长后，即为标准储备菌株。标准储备菌株应进行纯度和特性确认。标准储备菌株保存时，可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分装于小瓶中，建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30）等方法保存。低于-70或低温冷冻干燥方法可延长菌种保存时间。标准储备菌株可用于制备每月或每周1次转种的工作菌株。冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌株后，不等重新冷冻和再次使用。5.3 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加菌种变异的风险。1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代1次。必要时，

10、实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。5.4 工作菌株不可替代标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。5.5 实验室必须建立和保存其所有菌株的进出、收集、贮藏、确认试验以及销毁的记录，应有菌种管理的程序文件（从标准菌株到工作菌株），该程序包括：标准菌株的申购记录；从标准菌株到工作菌株操作及记录；菌种必须定期转种传代，并做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认，并记录；每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数；菌种生长的培养基和培养条件；菌种保藏的位置和条件；其他需要的文件。6 微生物限度检验实验室6.1 微生物限度检查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再污染。因此，微生物限度检查

11、通常应在环境洁净度C级下的局部A级的单向流空气区域内进行；限度检查实验室应配有相应的人流和物流缓冲间或传递窗（柜）。应按相关并定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证和日常监测。6.2 实验室对所有的消毒剂种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。6.3 注意进出洁净区时，相邻两门不能同时打开，并在人流和物流通道房间增加气锁。7 设备7.1 实验室配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备，其类型、测量范围和准确度等级应满足检验所采用标准的要求，设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准。7.2 实验室在仪器设备完成相应的检定、校准、验证、确认其性能

12、，并形成相应的操作、维护和保养的标准操作规程后方可正式使用，使用要有记录。为保证设备处于良好工作状态，应定期维护和期间核查，并保存相关记录。8 人员进出洁净区的要求8.1 进入洁净区的人员应身体健康，不得有传染病、皮肤病或体表伤口以及其它不适宜进入洁净区的身体状况。检验人员若有身体不适应按及时报告，按职工主动报告身体不适应生产情况管理办法记录和处理。8.2 进入洁净区的人员不得化妆，不允许佩戴饰物。8.3 人员按洁净区操作规程要求进出洁净区。8.4 洁净区内的人数应当严加控制，检查和监督应当尽可能在检验的洁净区外进行，特殊情况确需进入的，应当事先对个人卫生、更衣等事项进行指导、办理审批手续，经

13、批准后由本岗位人员陪同方可进入洁净区。9 物品进出洁净区要求9.1 试验所需的无菌器具及洁净服应按操作规程要求清洗、包装、灭菌、传递，并在灭菌有效期内按先进先出的原则使用。9.2 被检样品应按操作规程要求贮藏、标记、消毒、传递，并能够保证其完整性而其性状不改变。9 方法验证9.1 验证的基本要求符合下列条件之一的，应当对检验方法进行验证：采用新的检验方法；若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时；采用中华人民共和国药典及其他法定标准未收载的检验方法；法规规定的其他需要验证的检验方法。9.1.1 根据样品特性，制订检验方法和检验条件，并写出验证方案，保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂

14、等均符合试验要求，并按制订的方法进行试验。9.1.2 根据验证结果，判断是否符合设立的验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。9.1.3 验证试验的菌株使用35代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）。9.2 微生物限度检查法验证9.2.1 检验量9.2.1.1 固体及半固体（黏稠性供试品）制剂检验量为10g。9.2.1.2 液体制剂检验量为10ml。9.2.1.3 包装膜、袋等包装材料除另有规定外，每项检验量为100cm2。9.2.1.4 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外

15、，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。9.2.1.5 要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。9.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。如使用了乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。供试液的制备若需要用水浴加温时，温度不应超过45，30min。供试液从制备至加入检验用培养基不得超过1小时。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：9.2.2.1 液体供试品：取供试品10ml，加pH

16、7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。9.2.2.2 固体、半固体或黏稠液供试品：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（30005000r/min、2min4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的灭菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。蜜丸等需剪碎，放入匀浆杯。9.2.2.3膜、袋等包装材料供试品：用开孔面积为20cm2的灭菌金属模板放在试样的内层面

17、上，将无菌棉签用无菌0.9%氯化钠溶液稍沾湿，在板孔范围内擦拭，在板孔范围内擦拭5次，换1支棉签再擦拭5次，每个位置用2支棉签共擦拭10次，擦拭5个位置共100cm2，每支棉签擦拭后立即剪断，投入盛有30ml无菌氯化钠溶液的大试管中。全部擦抹棉签均投入管中后，将管迅速摇晃1分钟，即得1：10供试液。9.2.2.4 具抑菌活性的供试品当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：9.2.2.4.1 稀释法：取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌

18、培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。9.2.2.4.2 离心沉淀集菌法：取规定量的供试液， 500r/min，离心3min，取全部上清液混合，用于细菌检查。9.2.2.4.3 薄膜过滤法：采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45微米，直径一般为50毫米，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经滤膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的

19、微生物受损伤。取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，（即用1：10的供试液10ml）加至滤杯中过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml进行试验。（即用1：102的供试液各10ml）加至滤杯中，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数依据每种供试品的特性而定。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基制备一张滤膜。9.2.2.4.4 中和法：凡含贡、砷或防腐剂等的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液。9.

20、2.3 供试液的稀释9.2.3.1 取34支灭菌试管，分别加入9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。加稀释剂后，试管应立即塞上。9.2.3.2 另取1支1ml灭菌吸管吸1：10均匀供试液1ml，加入装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，混匀，即1：100供试液以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：103、1：104等适宜的稀释级（34）。每递增1稀释级，必须另换一支吸管。9.2.4 细菌、霉菌和酵母菌检查法的验证9.2.4.1 计数方法验证9.2.4.1.1 验证用菌株 大肠埃希菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢杆菌CMCC(B

21、)63501、白色念珠菌CMCC(B)98001、黑曲霉CMCC(B)98003。接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养1824h；黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基，培养5天7天。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含50cfu100cfu的菌悬液。9.2.4.1.2 验证方法 验证试验分四组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照试验组的菌回收率。9.2.4.1.2.1 试验组：取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50cfu100cfu试验菌，按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时

22、，取试验菌液、供试液1ml分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基；薄膜过滤法计数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。9.2.4.1.2.2 菌液组：取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。9.2.4.1.2.3 供试品对照组：取最低稀释级的供试液1ml，按菌落计数方法测定其所含菌数。9.2.4.1.2.4 稀释剂对照组：为考察供试液制备过程对微生物的影响程度，可用相应的稀释液替代供试液，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml含50cfu100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数9.2.4.1.2.5 试验

23、组的菌回收率（%）= 100%菌液组的平均菌落数 稀释剂对照组的平均菌落数9.2.4.1.2.6 稀释剂对照组的菌回收率（%）= 100%菌液组的平均菌落数9.2.4.1.3结果判断：稀释剂对照组的菌回收率菌应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌、霉菌或酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。9.2.4.1.4 验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。9.2.4.2 操作方法9.2.4.2.1 平皿法一般取适宜的连续23个稀释级的供试液进行细菌、霉菌和酵母菌数

24、测定。取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15ml温度不超过45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。阴性对照试验：取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，菌不得有菌生长。培养：一般细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于2328培养箱中培养5天。菌落计数。9.2.4.2.2 薄膜过滤法 取相当1g或1ml供试品的供试液直接过滤，或加至适量稀释剂中，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲洗后

25、取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。阴性对照：取试验用的稀释剂1ml同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。9.2.4.2.3 培养基稀释法取低稀释级供试液（原液或1：10供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿的中（每皿0.2ml或0.2ml），每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每1ml供试液等量分注5个或5个以上平板点计的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得2组数据。以2份低稀释级供试液菌落数的平均数乘以稀释倍数的值报告

26、。9.2.4.2.4 结果报告按细菌、霉菌及酵母菌的报告规则计数，当结果满足8.2.4.1.3的要求时，照此检查法和检查条件进行供试品的微生物限度检查。如结果不满足8.2.4.1.3的要求时，需改进后重新进行方法验证。9.2.5 控制菌检查法的验证9.2.5.1 验证用菌株及菌液制备9.2.5.1.1 验证用菌种大肠埃希菌CMCC（B）44102金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094铜绿假单胞菌CMCC（B）10104 生孢梭菌CMCC（B）64941菌液制备：分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的营养琼脂斜面培养物少许，各接

27、种至5ml营养肉汤培养基内，置3537培养18h24h，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10cfu100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18h24h。用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10cfu100cfu的菌悬液。9.2.5.2 供试液的制备见SOP-QC-SW-101微生物限度检查法6.2.2细菌、霉菌和酵母菌计数9.2.5.3 验证方法：除另有规定外，控制菌培养温度为3035。9.2.5.3.1 试验组：取规定量供试液及10cfu100cfu试验菌

28、加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为试验菌。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入增菌培养基中。9.2.5.4 结果判定：若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法作该供试品的控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应参照8.2.2.4中具抑菌活性的供试品项下操作，以消除供试品的抑菌活性。建立新的方法，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。9.2.5.5 大肠埃希菌检查法验证9.2.5.5.1 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种

29、至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，加入含10cfu100cfu的大肠埃希菌悬液做试验组，培养18h24h时，必要时可延长至48小时。9.2.5.5.2 MUG-Indole检查:取上述培养物，用灭菌吸管吸取0.2ml接种至含5mlMUG培养基管内培养，同时取1支5mlMUG培养基管接种阳性对照培养物0.2ml,分别在5小时、24小时,取未接种的MUG培养基管本底对照,将各管置365nm紫外光观察有无荧光。阳性对照应呈现荧光，MUG阳性，否则试验失败。供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性，无荧光，MUG阴性。然后加靛基质(Indole)试液45滴于上述MUG管内，观察液面颜色，呈玫瑰

30、红色为阳性，呈试剂本色为阴性。供试液按照表1的结果进行判断或做进一步的检查。表1 结果分析MUGIndole结果阴性阴性结果未检出大肠埃希菌阳性阳性报告检出大肠埃希菌阳性阴性需要进一步做如下检查阴性阳性需要进一步做如下检查9.2.5.5.3 分离培养取供试液增菌液及阳性对照培养液轻轻摇动，以接种环沾取培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18h24h，当阳性对照的平板呈典型菌落生长，若供试液的平板上无菌落生长、或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。表2大肠埃希菌菌落形态特征培 养 基菌 落 形 态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红色，菌

31、落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，带有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润9.2.5.6 大肠菌群检查法验证9.2.5.6.1 取装量10ml的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1：100的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml）、1：1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），加入含10100cfu的大肠埃希菌悬液做试验组，培养18h24h。9.2.5.6.2 胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管

32、未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18h24h。9.2.5.6.3 若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。表3大肠菌群菌落形态特征培 养 基菌 落 形 态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润麦康凯琼脂鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润9.2.5.6.4 确证试验 从上述分离平板上挑选取

33、45个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24h48h。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。9.2.5.7 铜绿假单胞菌检验法验证9.2.5.7.1 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，加入含10cfu100cfu的铜绿假单胞菌悬液做试验组，培养18h24h。9.2.5.7.2 取上述培养物，划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基的平板上，培养18h24h。9.2.5.7.3 铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有篮绿色素扩散。若平板上无菌落生长

34、，或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。9.2.5.8 沙门菌检验法验证9.2.5.8.1 取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其它适宜的方法混匀，加入含10cfu100cfu的沙门菌悬液做试验组，培养18h24h。9.2.5.8.2 取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养1824小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18h24h（必要时延长至40h48h）。9.2.5.8.3 若平板上无菌落生长，或生长的

35、菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出沙门菌。9.2.5.8.4 若平板上生长的菌落与表5所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选23个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18h24h，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色，底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。表4 沙门菌菌落形态特征培 养 基菌 落 形 态胆盐硫乳琼脂无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色沙门、志贺菌属琼脂无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色9.2.

36、5.9 金黄色葡萄球菌检验法验证9.2.5.9.1 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基中，加入含10100cfu的金黄色葡萄球菌悬液做试验组，培养18h24h，必要时可延长至48小时。9.2.5.9.2 取上述培养物，划线接种于卵黄高盐琼脂培养基或甘露醇高盐琼脂培养基的平板上，培养24h72h。9.2.5.9.3 若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表5所列的特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。表5 金黄色葡萄球菌菌落形态特征培养基菌落形态甘露醇氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围

37、有黄色环，菌落直径0.71mm。卵黄氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解后的乳浊圈，菌落直径12mm。9.2.5.10 梭菌的检验法验证9.2.5.10.1 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml）2份，其中1份置80保温10分钟后迅速冷却，上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的0.1新鲜庖肉培养基中，加入含10cfu100cfu的生孢梭菌悬液做试验组各培养基管在厌氧条件下培养72h96h。9.2.5.10.2 如试验管不出现浑浊、产气、消化碎、臭肉等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培养物0.2ml，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧

38、条件下培养48h72h。9.2.5.10.3 若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌。9.2.5.11 白色念珠菌的检验法验证9.2.5.11.1 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖液体培养基中，培养1872小时。9.2.5.11.2 取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。9.2.5.11.3 白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上

39、述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。若平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选23个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。9.2.5.11.4 若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上，培养2448小时。取培养物进行染色、镜检及芽管试验。9.2.5.11.5 牙管试验挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上载玻片，置湿润的平皿内，于3537培养13小时，置显微镜下观察孢子上有否

40、长出短小芽管。若上述疑似菌为革兰氏阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。9.2.5.11 结果判断若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。若试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。10 制定检验方法SOP10.1 各品种经方法验证后制定该品种的微生物限度检验方法SOP。10.2 检验操作依现行的微生物限度检验方法SOP规定进行。11检验方法11.1供试液的制备一般供试品的检验量为10g或10ml；膜、袋等包装材料100cm2；贵重药品、微量包

41、装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用加温时，应均匀加热，且温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。除另有规定外，常用供试液制备方法如下。11.1.1液体供试液取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。11.1.2固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g，加pH7.

42、0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。必要时加入适量的无菌聚山梨80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。特殊情况按客户提供方法制备，新增品种按验证的方法制备。11.1.3非水溶性供试品取供试品5g(5ml)，加至溶化的（温度不超过45）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20的供试液。11.1.4膜、袋等包装材料供试品用开孔面积为20cm2的灭菌金属模板放在试样的内层面上，将无菌

43、棉签用无菌0.9%氯化钠溶液稍沾湿，在板孔范围内擦拭，在板孔范围内擦拭5次，换1支棉签再擦拭5次，每个位置用2支棉签共擦拭10次，共擦拭5个位置100cm2，每支棉签擦拭后立即剪断（或烧断），投入盛有30ml无菌氯化钠溶液的大试管中。全部擦抹棉签均投入管中后，将管迅速摇晃1分钟，即得供试液。11.2细菌、霉菌及酵母菌计数除另有规定外，细菌培养温度为3035；霉菌、酵母菌培养温度为2328。检查结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为报告,特殊品种可以最小包装单位报告。计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。按计数方法的验证试

44、验确认的程序进行供试液制备。用稀释液稀释成1：10、1:102等稀释级的供试液。11.2.1 平皿法11.2.1.1供试品检验：根据菌落报告规则取相应稀释级的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15ml20ml温度不超过45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母进出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。11.2.1.2阴性对照试验：取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基至少制备2个平板，均不得有菌生长。11.2.1.3培养和计数：除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察

45、菌落成长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数，点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌落报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉栋葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营

46、养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌落为计数结果。含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。11.2.1.4 菌数报告规则细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数在小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。若两个稀释级的菌落数均超出范围，需重试。11.2.2 薄膜过滤法11.2.2.1 供试品检验：采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45微米，直径一般为50毫米，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经滤膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，（即用1：10的供试液10ml）加至滤杯中过滤。若供试