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1、第三十四章临床标本微生物学检验概述本章考点：临床标本微生物学检验（血液、脑脊液、痰、尿液、粪便、性传播疾病、创伤）（1）常见病原菌（2）标本采集及运送（3）检验方法（4）临床意义一、临床标本细菌检验的基本程序二、血液感染正常人的血液是无菌的。菌血症是指在血液中可检测到细菌，包括一过性和持续性在血中存在。败血症是指病原菌侵入血流后，在其中大量繁殖并产生毒性产物，引起全身中毒症状。脓毒血症是指化脓性细菌败血症时，细菌通过血流扩散至全身其他组织或器官，产生新的化脓性病灶。（一）常见病原菌见表5-34-1（二）标本采集1.采血时间和频率：一般在病人发热初期或高峰期采集，或根据不同的发热情况在未用抗生素
2、前采集。但怀疑细菌性心内膜炎时，血培养不少于三次。2.采血量：一般为静脉采血，采血量一般以培养液体积的1/10为宜。成人采血量1020ml，儿童35ml；婴儿12ml。3.床边直接注入血液培养基，否则用SPS抗凝剂送检，不得用EDTA，枸橼酸钠抗凝。4.检查血管内导管有无细菌污染，可无菌操作，剪下导管5cm远侧段，置无菌容器内送检。（三）微生物分离培养和鉴定1.培养基的选择：为提高阳性率通常先用增菌培养基培养。用自动血培养分析仪时选用相应的血培养瓶，如需氧+厌氧，需氧+高渗等。2.分离和鉴定：当观察有细菌生长时或血培养仪阳性报警时，应及时作如下检验：（1）涂片染色镜检，结果及时与临床联系。（2
3、）转种血平板、巧克力平板、厌氧血平板或其他特殊培养基等分离培养纯菌再进行鉴定。（3）同时做药敏试验，结果及时报告临床作治疗参考。（四）报告方式阴性结果：7天报告无细菌生长。疑为亚急性细菌性心内膜炎、布鲁菌病、厌氧菌血症、真菌血症时，血培养至少连续培养23周，仍无细菌生长者可报告为阴性。阳性结果：三级报告方式：第一级报告告知标本已出现阳性并报告直接细菌涂片结果，同时做初步药敏试验；第二级是报告初步药敏结果，同时做正式鉴定和药敏试验；第三级报告正式鉴定和药敏试验结果。（五）临床意义葡萄球菌菌血症常由疖、痈、脓肿及烧伤创面等原发感染灶继发，也可由呼吸道感染引起。一些革兰阴性杆菌主要侵犯、危及机体免疫
4、功能低下的病人。耐药菌株不断增加。厌氧菌的菌血症常合并需氧菌感染，临床症状较重而复杂。L型菌的菌血症主要由于使用抑制细菌细胞壁合成的抗生素后，由缺损细胞壁的细菌感染所致。免疫低下者常出现真菌菌血症。院内感染菌血症不断上升。三、中枢神经系统感染（一）常见病原菌见表5-34-2（二）标本采集用药前，无菌操作腰穿方法采集23ml，盛于无菌试管常温下立即送检。天冷时保温，不可冰箱保存。用于病毒检测时应冷藏送检。（三）检验方法1.涂片镜检：离心3000rpmmin，15分钟。革兰染色（一般细菌）、抗酸染色（分枝杆菌）、墨汁染色（隐球菌）、电镜检查（病毒颗粒）。2.分离培养：5gL葡萄糖增菌肉汤、血平板、
5、中国蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板、巧克力平板。结核菌接种罗-琴培养基或米氏7H10培养基。真菌培养接种沙氏培养基。病毒培养常用动物接种、鸡胚接种、细胞培养。3.血清学检测可直接检测抗原。（四）临床意义细菌性脑膜炎是中枢神经系统感染的常见类型。真菌性脑膜炎最常见于隐球菌脑膜炎，其他的真菌性脑膜炎如白假丝酵母、球孢子性脑膜炎日渐增多，特别是免疫功能低下和恶性疾病患者易发。流行性乙型脑炎可获得持久免疫力，再次发病者极少见。肠道病毒对中枢神经系统的危害性逐渐引起人们的关注和重视。四、呼吸道感染呼吸道按解剖结构分为上呼吸道和下呼吸道。上呼吸道感染主要指喉及喉以上的呼吸道感染。下呼吸道感染主要指气管、支气管
6、和肺的感染。（一）上呼吸道的正常菌群见表5-34-3（二）常见病原菌见表5-34-4（三）标本采集（1）上呼吸道常采用鼻咽拭子，用可弯曲的拭子，在鼻咽腔转动数次采集标本，置运输培养基中送检。在扁桃体部位、咽后壁及口腔内炎症、溃疡或渗出部位采样时，应先用清水漱口，再采集标本。（2）下呼吸道常采用自然咳痰法、支气管镜采集、胃内采集、咽拭子。清晨第一口痰为宜，最好在用抗菌药物前采集，必须先用清水漱口，避免唾液混入。立即送检。（四）检验方法1.涂片：检查细菌常用革兰染色、抗酸染色。检查隐球菌采用墨汁染色，军团菌、支原体、病毒等可用免疫荧光抗体染色。痰涂片革兰染色还可用于判定痰标本的质量。合格的痰标本应
7、是含白细胞、脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多，而受污染的痰标本则是来自颊黏膜的扁平上皮细胞较多。以白细胞25个低倍视野，而鳞状上皮细胞105cfuml，革兰阳性球菌104cfuml，有诊断意义。细菌数104cfuml，多为污染。104cfuml105cfuml，可疑阳性。3.尿路感染的细菌数少于105 cfuml时多见于以下几种情况：应用抗菌药物，尿中细菌发育受到抑制；使用低敏感性药物，大多数细菌停留在104cfuml；尿浓度变化大时及pH在5.0以下8.5以上，则发育受阻；尿频时；病原菌发育要求条件高时；采尿时外阴部消毒剂混入尿中。六、消化道感染消化道感染常见于细菌性痢疾，细菌性食物中毒，消化
8、道溃疡，胃肠炎等。（一）常见病原菌见表5-34-6（二）标本采集与运送1.采集时间：急性期、尽量在用药前采集。2.采集方法：自然排便采集法、直肠拭子。取含脓血或粘液的粪便置清洁容器中送检。排便困难者，可用直肠拭子采样。标本不能及时接种时，应在标本中加保护剂或用相应的运输培养基。传染性腹泻病人，一般应连续作三次培养以明确诊断，治疗后亦应连续作三次培养，以明确治疗效果。（三）分离培养普通致病菌如沙门菌、志贺菌等可选用SS琼脂平板、中国蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板。特殊细菌如弯曲菌、弧菌、厌氧菌等选择相应的选择性培养基。病毒可用细胞培养。（四）临床意义感染性腹泻由多种病原体感染所致。消化性溃疡由幽门螺
9、杆菌感染引起。轮状病毒常引起幼儿腹泻，腺病毒是引起儿童腹泻的主要病原，还可引起成人腹泻，埃可病毒常引起婴幼儿腹泻；Norwolk病毒常感染成人和大龄儿童。七、性传播疾病性传播疾病是指以性行为为主要传播途径的一组传染病。（一）常见性传播疾病及其病原体性传播疾病病原体梅毒梅毒螺旋体淋病淋病奈瑟菌软下疳杜克嗜血杆菌性病淋巴肉芽肿沙眼衣原体性病淋巴肉芽肿生物亚种细菌性阴道病阴道加德纳菌和类杆菌等厌氧菌非淋菌性尿道炎沙眼衣原体沙眼生物亚种、支原体尖锐湿疣人乳头瘤病毒生殖器疱疹人类单纯疱疹病毒2型（二）标本采集一般用拭子取尿道脓性分泌物（男性）或宫颈分泌物（女性），供培养及镜检；梅毒病人取皮肤渗出液和淋巴
10、穿刺液涂片；疱疹抽取疱内液体，或刺破小疱后，用无菌拭子采样。（三）检验方法参见前面相应章节。八、创伤和外科感染（一）常见病原菌 见表5-34-7（二）标本采集组织创伤用拭子采取标本，创伤范围大时，应多部位采集标本送检；施行清创术时，可选择合适部位采集标本送检；骨髓炎病人应取骨髓活检标本，如损害部位已形成窦道，可采取窦道引流液；脓肿时取内部脓汁及脓肿壁标本。（三）临床意义由创伤、手术、侵人性器械操作等外科治疗引起的感染最为常见。感染以化脓性炎症改变为主。外伤性创伤感染以葡萄球菌和链球菌多见，放线菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌也常见，且易发生混合感染。深部创伤易引起破伤风和气性坏疽。烧
11、伤创面以革兰阴性杆菌最常见，次为革兰阳性球菌感染。急性化脓性骨关节炎常由金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、淋病奈瑟菌感染所致。慢性化脓性骨关节炎、慢性骨髓炎常由结核分枝杆菌引起，葡萄球菌、链球菌也常见。放线菌多引起内源性感染。本章练习题：引起肺部感染的病原菌中，能从痰标本检出的有A.金黄色葡萄球菌B.肺炎链球菌C.肺炎克雷伯菌D.结核分枝杆菌E.肺炎支原体答疑编号500735340101正确答案ABCDE标本采集和处理的基本要求包括A.抗菌药物治疗前采集标本B.根据病原微生物感染特点，采集不同部位标本送检C.无菌操作，采集标本时需先消毒D.应用无菌容器收集标本，立即送检E.检材容器贴上
12、患者姓名、标本名称等项目的标签答疑编号500735340102正确答案ABCDE 性传播疾病应采集的标本是A.脑脊液B.胸水、腹水C.心包液、滑囊液D.尿道脓性分泌物（男性）E.宫颈分泌物（女性）答疑编号500735340103正确答案DE 根据目的不同临床采集的标本包括A.尿液B.粪便C.血液D.鼻咽拭子E.脑脊液及其他体液答疑编号500735340104正确答案ABCDE第三十五章细菌对药物的敏感试验本章考点： 1.临床常用抗菌药物简介（1）临床常用抗菌药物分类及作用原理（2）抗菌药物选择原则2.需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验（1）KB法、稀释法试验原理（2）KB法、稀释法试验方
13、法（3）KB法、稀释法试验结果解释（4）KB法、稀释法试验影响因素（5）杀菌试验（6）体外联合药敏试验3.其他菌的体外抗菌药物敏感试验（1）厌氧菌体外药敏试验方法（2）结核分枝杆菌体外药敏试验方法（3）真菌体外药敏试验方法4.体内抗菌药物的活性和浓度测定（1）原理（2）方法5.耐药菌株的监测（ESBLs、MRS、HLAR、VRE、PRP、AmpC酶）（1）耐药机制（2）耐药表型检测方法（3）耐药菌抗生素应用原则 第一节临床常用抗菌药物简介 一、临床常用抗菌药物简介 表5-35-1临床常用抗菌药物 抗生素分类代表药物作用机制青霉素类不耐受-内酰胺酶：氨苄西林、哌拉西林、替卡西林、青霉素G耐-内酰
14、阻断细菌细胞壁肽聚糖的合成头孢菌素一代：头孢噻吩、头孢咗啉二代：头孢呋辛三代：头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮四代：头孢吡肟阻断细菌壁肽聚糖的合成其他-内酰胺类单环-内酰胺类：氨曲南碳青霉烯类：亚胺培南、美洛培南阻断细菌细胞壁肽聚糖的合成-内酰胺酶抑制剂头霉素类：头孢西丁、头孢替坦棒酸、他唑巴坦、舒巴坦与-内酰胺酶有较高的亲全性以竞争性和不可逆的抑制方式发挥作用氨基糖甙类庆大霉素、链霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星与细菌核糖体30S小亚基不可逆结合，抑制mRNA的转录和蛋白合成喹诺酮类诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左旋氧氟沙星作用于DNA旋转酶，干扰DNA的复制、修复和重组大环内酯类红
15、霉素、克拉霉素、阿齐霉素、罗红霉素可逆结合细菌核糖体50S大亚基抑制蛋白合成，阻止肽链延长林可酰胺类克林霉素结合细菌核糖体50S大亚基，抑制蛋白合成，阻止肽链延长四环素类四环素、强力霉素、米诺环素结合细菌核糖体30小亚基，抑制蛋白合成，阻止肽链延长氯霉素类氯霉素结合细菌核糖体50S大亚基，抑制蛋白合成，阻止肽链延长磺胺类及增效剂复方磺胺甲唑增效剂：甲氧苄胺嘧啶磺胺类竞争结合二氢叶酸合成酶增效剂结合二氢叶酸还原酶，抑制细菌生长硝基呋喃类呋喃妥因、呋喃唑酮干扰细菌的氧化还原系统，阻断细菌的代谢糖肽类万古霉素、替考拉宁阻断细菌细胞壁肽聚糖的合成二、药敏试验中抗菌药物的选用按临床需要选用抗菌药物的种类
16、。同类抗菌药物仅选一个作为代表。根据测定细菌的种属和感染部位进行选药，参考NCCLS公布的抗菌药物敏感性试验执行标准。抗菌药物在标准中分为四组：A组为常规首选药敏试验药物。B组包含一些临床上重要的，特别是针对医院内感染的药物，也可以用于一级试验。但是，它们只是被选择性地报告，例如当细菌对A组同类药物耐药时，可以选用。其他报告指征可包括以下几点：特定的标本来源（如三代头孢菌素对脑脊液中的肠道杆菌或者TMPSMZ对泌尿道的分离菌株）；多种细菌感染；多部位感染；对A组药过敏、耐受或无效的病例；为流行病学调查目的向感染控制组报告。C组包括替代性或补充性抗微生物药，可在以下情况进行试验：某些单位潜伏存在
17、有对数种基本药物（特别是对同类的，如-内酰胺类或氨基糖苷类）耐药的，局部流行或广泛流行的菌株；治疗对基本药物过敏的患者；治疗少见菌的感染（如氯霉素对沙门菌属或某些假单胞菌属）；为流行病学目的向感染控制组报告。U组仅用于治疗泌尿道感染的抗微生物药（如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物）。除泌尿道，其他感染部位分离的病原菌不用此组药物进行试验。 第二节细菌对药物的敏感试验 细菌对抗菌药物的敏感试验（药敏试验）是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验。药敏试验主要用于：帮助临床医师选择效果最佳的药物进行感染性疾病的治疗，以避免由于抗菌药物使用不当造成的许多不良后果；进行流行病学调查，了解本院、本地区致病菌
18、的耐药性变迁情况，以便在宏观上控制耐药性的发生发展，对于院内感染的控制也具有积极意义；药敏试验结果还可以用来做某些细菌的鉴定。指导有关部门制定流行耐药菌的防治措施。一、扩散法（K-B法）目前常用的方法是纸片琼脂扩散法，是一种半定量的方法。美国NCCLS纸片扩散法敏感试验分委会所推荐的标准方法是以Bauer-Kirby建立的K-B法，是目前公认的标准实验方法。（一）原理将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位，该点称为抗菌药源。药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着药源距离加大，琼脂中药物浓度逐渐减少的梯度浓度。其药源周围一定区域的琼脂内药物浓度恰高于
19、抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细菌不能生长，形成透明抑菌圈。抑菌圈的大小可以反映待检菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。（二）材料1.培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH7.2，琼脂厚度为4mm。对生长条件要求高的细菌，如链球菌属等细菌须在M-H琼脂中加入5%的脱纤维羊血。嗜血杆菌属细菌需补充1%血红蛋白（含V因子）和1%X因子复合物。2.抗菌药物纸片：选择直径6.35mm，吸水量20l的专用药敏纸片。3.菌液（1）菌液标准比浊管的制备：0.048molL（1.175%）氯化钡0.5ml加0.18molL（1%）硫酸溶液9
20、9.5ml，充分混匀，其浊度为0.5麦氏比浊标准，相当于1.5108ml的含菌量。（2）接种菌液的准备：用接种环挑取琼脂平板上形态相同的菌落45个，接种于35ml水解酪蛋白（M-H）肉汤中，35培养28h。链球菌属和嗜血杆菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准，校正后的菌液应在15min内接种。（三）实验步骤以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液，并在管壁上拧压一次，均匀涂布接种于M-H琼脂表面，涂布三次，每次平板旋转60角，最后沿平板内缘涂抹一周，盖上皿盖，置室温干燥35min后用无菌镊子或贴纸片机将含药纸片贴于含菌琼脂表面。纸片应贴得均匀，各纸片中心距离不小于
21、24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。直径为90mm的平皿可贴6张纸片。纸片贴牢后避免移动，因为有些药物立即就可扩散于琼脂内。平板经室温放置15min再倒放于35培养箱中培养1618小时后阅读结果。（四）结果判读平板置黑色无反光背景上，从平板背面用卡尺、毫米尺或特制的模板测量包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。抑圈菌的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。参照标准解释结果。每批试验都应做标准菌株对照，只有对照菌株的敏感度符合标准，实验结果才是可靠的。试验结果解释分为三级，即敏感（S）：表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。中介度（I）：不是敏感性的度量，这一范围作为“
22、缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控导致的结果偏差，因而其临床意义是不确定的，故不应作临床报告，通过提高测定药物的剂量或在该药物浓度较高的部位（如尿液、胆汁等），细菌生长可被抑制。耐药（R）：表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制检测菌生长。（五）质量控制1.质控菌株：采用标准菌株是进行质控的主要措施，应从可靠的菌保种保藏中心索购，金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853及粪肠球菌ATCC29212或33186用于对试验结果进行监测。2.抑菌圈质控范围：每种抗菌药物对四个质控菌株的抑菌圈允许范围，为95%的可信限，即实验室日间质
23、控得到的抑菌圈直径在连续20个数值中，仅允许有一个超出这个范围。如果经常有质控结果超出这个范围，说明实验方法不稳定。每日质控抑菌圈直径的均值应接近允许范围的中间值，否则说明操作中有不规范之处，应予以调整。一旦发现失控，应从培养基、纸片、接种菌液等方面去查找原因，并及时纠正。（六）影响结果的因素1.培养基：培养基的成分对结果的准确性有直接影响，有些抗菌药物的抑菌或杀菌力可被多种物质所拮抗，如某些蛋白质及氨基酸等对磺胺类药物即有不同程度的拮抗作用；培养基的酸碱度以pH7.27.4为最适宜，碱性可扩大氨基糖苷类药物的抑菌圈，酸性可扩大四环素族药物的抑菌圈；琼脂含量的多少可影响抑菌圈的大小。对每批M-
24、H琼脂平板均需进行检测，合格后方可使用。2.抗菌药物纸片：纸片含药量是影响抑菌圈大小的主要因素，而纸片含药量又与纸片的重量、吸水性、直径等有关。批量制备的抗菌药物纸片，务使每张纸片所含的药物浓度相同；抗菌药物纸片应妥善保存，如保存不当可使药物效力降低，致使抑菌圈缩小。保存条件以低温干燥为佳。3.菌量：加大菌量可使抑菌圈减小，相反可使抑菌圈扩大，因此菌量应相对固定。4.操作质量（1）培养基的厚度对抑菌圈的大小有影响，故平皿中加入培养基要固定，以4mm深度为宜。制备的平板使用时应放于35温箱中30min去除过多的水分，以免影响抗菌药物的扩散。（2）接种细菌后应在室温放置片刻，待菌液被培养基吸收后，
25、再贴纸片；但不宜放置太久，否则在贴纸片前细菌已开始生长可使抑菌圈缩小。（3）培养温度为35为宜。堆放试验平板不超过两个，使其受热均匀。（4）测量抑菌量应仔细、精确，从生长刺激带测量。二、稀释法稀释法是体外定量测定抗菌药物抑制待测菌生长活性的方法，抗菌药物可在液体或固体培养基中稀释。根据稀释培养基的不同，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。琼脂稀释法是细菌药敏试验的金标准。稀释法所测得的某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度为最低（或最小）抑菌浓度（MIC），稀释法也可测定最小杀菌浓度（MBC）。（一）肉汤稀释法1.原理：以水解酪蛋白（M-H）液体培养基将抗菌药物作不同浓度的稀释，然后接种待测菌，定量测定抗
26、菌药物抑制该菌的最低浓度（MIC）或杀死该菌的最低（或最小）杀菌浓度（MBC）。2.材料（1）抗菌药物原液的配制：配制各种抗菌药物原液的溶剂一般为蒸馏水、磷酸盐缓冲液或乙醇等，稀释剂多为蒸馏水。配制时需用标准粉剂并了解其效力（效价），用下列公式计算配制抗菌药物原液一定浓度所需要标准粉剂的毫克数。A：称取标准粉剂的毫克数B：稀释剂的毫升数C：储存液的浓度（即原液浓度，Uml或gml）D：标准粉剂的有效力（即效价，Umg或gmg）最后，原液以过滤法除菌，小量分装使用。大部分抗菌药物原液在-20以下可保存三个月，而在4以下只能保存一周。（2）培养基：一般细菌采用M-H液体培养基；链球菌和嗜血杆菌属除
27、培养基为液体外，其他需补充的成分均同K-B法。（3）接种菌液的制备：在已分纯的待测菌平板上挑取45个形态相同的菌落接种于35ml M-H液体培养基内，35培养46h；链球菌属和嗜血杆菌属的细菌需接种于含血液的M-H液体培养基，35培养过夜，校正菌液浓度，使其相当于0.5麦氏比浊标准，再用M-H液体培养基按1：200稀释后备用。稀释后的菌液应在15min内接种。3.试验步骤（1）各管抗菌药物的最终含量依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03gml。另设培养液对照，检测菌生长对照和质控菌生长对照管各一支。（2）将已校正浓度的待测
28、菌悬液依次加入含药管内，混匀。各试管置35培养1618h后观察结果。每次以同法作对照菌的药敏试验。4.结果判读：凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该待测菌最低抑菌浓度 （MIC）。再以0.01ml容量接种环取肉眼观察认为无菌生长的试管移种一环于血琼脂平板作次代培养，经35培养过夜后观察最低药物浓度能杀死99.9%原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度（MBC）。5.影响结果的因素（1）培养基：培养基的pH、渗透压及电解质对MIC和MBC均有影响。（2）抗菌药物：抗菌药物必须采用标准粉剂。配好的药物原液应在有效期内使用。（3）结果观察时间：应在1218h之间观察。培养时间过长，被轻度抑制的部分
29、细菌可重新开始生长；另外由于某些抗菌药物不够稳定，培养时间过长使其抗菌活性降低，甚至消失，从而使MIC值增高。6.质量控制：每次实验时应根据待测菌的不同而分别选用：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在同一试验条件下作平行试验，常用抗菌药物对这些标准菌株的MIC应在预期值范围内。超过或低于预期值范围一个稀释度以上，不应向临床发出报告，应检查出现差错的原因以及标准菌株被污染和变异的可能性。三、杀菌试验临床实验室常用的定量评价抗菌药物杀菌效力的试验主要包括最低杀菌浓度（MBC）试验和杀菌曲线法。1.最低
30、杀菌浓度：最低杀菌浓度是某抗菌药物能杀灭99.9%以上的测试菌量的最低药物浓度。测定方法就是稀释法MIC测定的基础上通过再转种、再孵育，最终测得某种抗菌药物对被测菌的MBC。2.时间-杀菌曲线：时间-杀菌曲线主要用于评价一种抗菌药物对测试菌的杀菌速率，以及两种或两种以上抗菌药物对测试菌的联合杀菌活性。操作时培养基和测试菌的准备等与测定MIC的肉汤稀释法相同，设定0小时、4小时、8小时、24小时等不同培养时间的试验管，对每个管均设立生长对照管，每个试验管在到达孵育时间后，立即连同生长对照管转种血平板进行菌落计数。最后将各时间点测得的平均菌落计数在半对数坐标纸上绘制杀菌曲线。四、体外联合药物敏感试
31、验（一）联合抑菌试验1.试管棋盘（方阵）稀释法：首先分别测定拟联合的抗菌药物，如A药和药对被测菌的MIC，根据A药和药的MIC确定药物联合测定的稀释度。一般选择68个稀释度左右，每种药的最高浓度为其MIC的2倍，棋盘稀释法如下表5-35-2：设A菌MIC=32gml，B菌MIC=8gml。实验操作方法同试管法MIC测定，根据测定结果按下列公式计算部分抑菌浓度指数（FIC）。FIC=A药联合时的MICA药单测的MIC+B药联合时的MICB药单测的MIC判断标准：FIC指数2拮抗作用2.微量棋盘（方阵）稀释法3.琼脂棋盘（方阵）稀释法（二）联合杀菌试验联合杀菌试验所用的方法同前述的时间-杀菌曲线法
32、。分别测定并绘出两种药物对被测菌的单独杀菌曲线和联合后的杀菌曲线，根据杀菌曲线判断联合用药的结果。五、厌氧菌、结核分枝杆菌及酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验（一）厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.稀释法：除培养基（布氏肉汤）、操作环境和培养条件（厌氧）等根据厌氧菌的特定需要变动外，基本原理和方法与需氧菌稀释法药敏试验相同。2.Etest试验：原理同以上所述，唯一区别就是培养环境为厌氧。根据测试厌氧菌种类不同孵育时间可分为24h、48h或72h。（二）结核分枝杆菌体外抗菌药物敏感试验1.结核分枝杆菌和缓慢生长分枝杆菌体外抗菌药物敏感试验：主要有比例法、绝对浓度法和耐药率法。每种方法又分直接法和间接
33、法。目前最常使用的方法是间接比例法。基本方法就是用制备好菌悬液同时接种含有抗菌药物的培养基和不含抗菌药物的生长对照培养基，如果含有抗菌药物培养基上的细菌生长量超出生长对照培养基上生长量的1%时即判断为耐药。间接放射性同位素法用BECTECA60结核分枝杆菌培养及药敏仪。2.快速生长分枝杆菌体外抗菌药物敏感试验采用肉汤稀释法和琼脂纸片洗脱法。（三）酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验1.常量肉汤稀释法（1）药物稀释：将待测的抗菌药物用配好的1640培养基进行一系列稀释，浓度为待测浓度的10倍，分别加入试管内，每管0.1ml。（2）接种菌悬液准备：测试菌先接种沙保弱琼脂，念珠菌和球拟酵母菌属孵育24h
34、，新型隐球菌孵育48h，挑取5个直径1mm的菌落混悬于5 ml生理盐水中，校正至0.5麦氏浊度。接种前用生理盐水再稀释1：100，最后用1640培养基再稀释10倍。最终接种菌量为11035103CFUml，每次的接种量，用定量涂种沙保弱平板进行菌落计数验证。（3）接种、孵育：将0.9ml的菌悬液接种至各试管中，同时设生长对照和阴性对照管，混匀后置35孵育48h。（4）结果判断：肉眼观察各管的生长情况，二性霉素B的MIC为抑制测试菌肉眼可见生长的最低药物浓度。5-氟胞嘧啶和吡咯类常采用80%MIC判断标准，即抑制80%检测菌生长的最低药物浓度为其MIC。取无药生长对照管中的测试菌液0.2ml，加
35、到含0.8 ml培养基的试管中混匀后作为80%检测菌抑制的比浊标准。（5）质量控制：就是采用标准菌株在与测试菌相同条件下进行药敏试验，以监测整个药敏系统是否正常、可靠。质控菌株为啤酒酵母菌（ATCC9763）2.微量稀释法：培养基、药物稀释、按种菌的准备以及结果判断均与以上的常量肉汤稀释法相同。六、体内抗菌药物的活性与浓度测定（一）体内抗菌药物的浓度测定1.微生物测定法：分为比浊法、试管稀释法和琼脂扩散法等三类方法，前二者因准确性较差现已很少使用。琼脂扩散法又分多种，其中纸片法简便易行。针对某一种抗生素应选择对其敏感而尽量对其他药物耐药的指示菌，利用直径6.3mm，吸水量为20 ml的滤纸片和
36、该抗菌药的标准液制成标准药敏纸片。将一定量的指示菌加入营养琼脂平板，将标准药敏纸贴在含有指示菌的营养琼脂上，每种抗生素至少同时测定4种浓度，每种浓度至少平行进行2组，35孵育l620小时，测量抑菌圈直径，以直径的平均值为横坐标，标准液浓度为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。被测标本按同样程序操作，得到抑菌圈直径后，可在标准曲线上读出相应的抗菌药物含量。如果抑菌圈过大超出标准曲线范围，则应将标本稀释重复操作。2.非微生物法（1）荧光偏振免疫测定。（2）高压液相层析法。（3）均相免疫测定法。（4）放射免疫测定法。以上方法各有优缺点，根据实际情况采用。（二）体内抗菌药物的活性测定临床微生物学实验室测
37、定体液内抗菌药物活性的方法，有血清抑菌力和杀菌力测定，其原理与肉汤稀释法测MIC，以及MBC的原理类同。病人给药后于峰浓度和谷浓度时各取血23ml，分离血清备用，自病人自身感染部位分离病原菌，制备接种菌液，用MH肉汤将病人血清依次稀释，稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：161：512，接种制备好的菌悬液，最终浓度为5105CFUml。35培养1824h，同时设立对照管，可按照测定MBC的要求测定其杀菌力。一般认为血清抑菌力杀菌力高于1：8或1：16时，认为治疗方案有效，如为严重感染，血清抑菌力杀菌力应高于1：64。第三节细菌的耐药性和产生机制 作用机制抗生素阻断细菌细胞壁肽聚糖的合成青霉
38、素类、头孢菌素、单环-内酰胺类、碳青酶烯类、糖肽类结合细菌核糖体50S大亚基，抑制蛋白合成大环内酯类、林可酰胺类、氯霉素类结合细菌核糖体30S小亚基，抑制蛋白合成氨基糖甙类、四环素类作用于DNA螺旋酶，抑制DNA合成喹诺酮类干扰细菌氧化还原系统，阻断代谢硝基呋喃类竞争结合二氢叶酸合成酶磺胺类一、细菌耐药的机制1.产-内酰胺酶：是细菌对-内酰胺类药物耐药的主要机制。水解药物-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性。2.产生钝化酶：如氨基糖甙类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶等。3.青霉素结合蛋白的改变：如MRSA的耐药机制。新的抗生素低亲和力的青霉素结合蛋白（PBP）或PBP本身发生修饰导致对抗生素的亲和力
39、下降。4.药敏作用靶位的改变：如核糖体位点的改变引起大环内酯类、林可霉素耐药。5.抗菌药物渗透障碍（1）外膜蛋白减少：如铜绿假单胞菌失去特异性外膜蛋白D2后对亚胺培南耐药。（2）药物外排作用：是细菌对四环素、大环内酯类等抗生素耐药的主要机制。二、细菌耐药性表型的检测1.超广谱-内酰胺酶（ESBLs）（1）超广谱-内酰胺酶（ESBLs）常见于肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌及大肠埃希菌。ESBLs可以水解青霉素，一、二、三代头孢菌素和氨曲南，但头霉菌素和碳青酶烯类不受影响。（2）K-B法筛查可选用头孢泊肟17mm、头孢他啶22mm、头孢噻肟27mm、氨曲南27mm、头孢曲松25mm。确认试验：KB法贴
40、两组纸片头孢他啶、头孢他啶棒酸；头孢噻肟、头孢噻肟棒酸，若两组中任何一组加棒酸的抑菌环直径与相应不加棒酸的抑菌环直径相差5mm，则判断此菌为产ESBLs菌株。稀释法若两组中任何一组加棒酸的MIC值比相应不加棒酸的MIC值降低3个以上稀释倍数，则判断此菌为产ESBLs菌株。（3）产ESBLs的克雷伯菌属及大肠埃希菌分离株，临床上可能对青霉素类、头孢菌素类及氨曲南治疗无效，即便体外有时敏感。对所有产ESBLs的菌株应当报告为耐所有青霉素类、头孢菌素类及氨曲南。2.葡萄球菌属（1）MRS对耐甲氧西林的耐药是由于本身存在的MecA基因编码的异常PBPs所致。MRS除对甲氧西林耐药外，还常常对其他类抗生
41、素耐药，呈现多重耐药性。（2）MRSA筛选需要含4%NaCl的MH琼脂。其抗生素含量为6gml苯唑西林或10gml的甲氧西林，培养条件空气3524h。（3）MRS是耐甲氧西林的葡萄球菌，它对头孢菌素和复合性内酰胺类如阿莫西林克拉维酸、氨苄西林舒巴坦、替卡西林克拉维酸、哌拉西林三唑巴坦和亚胺培南可在体外显示活性但临床无效，因此不应报告敏感。（4）VISAGISA是对万古霉素敏感性处于中介度的金黄色葡萄球菌，MIC=8-16gml，对于抑菌圈14mm的金黄色葡萄球菌的敏感性无法解释，应进一步测试其MIC值。VISAGISA对万古霉素的非敏感性机制尚不清楚。3.肠球菌属（1）对氨基糖甙类呈耐药性的肠
42、球菌（HLAR）的测定用高浓度庆大霉素或链霉素进行高水平耐药筛选，可预测氨苄西林、青霉素或万古霉素和一种氨基糖甙类的协同效应。（2）纸片扩散法:庆大霉素（120g）、链霉素（300g）判断：直径6mm，耐药；1Omm，敏感；79mm用稀释法测定。稀释法：1）肉汤稀释法脑心浸液肉汤+庆大霉素500（gml）或链霉素（1000gml）；2）琼脂稀释法脑心浸液琼脂+庆大霉素（50%gml）或链霉素（2 000gml）。判断：生长出菌落为HLAR。（3）对于肠球菌属，头孢菌素、氨基糖甙类（筛选高水平耐药除外）、克林霉素和磺胺类可在体外显示活性，但临床无效，不应报告敏感。（4）耐万古霉素的肠球菌（VRE）获得性耐药分两种表型，VanA和VanB，天然耐药为VanC型。琼脂筛选法：脑心浸液琼脂+万古霉素6gml，判断：菌落生
