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1、CMA芯片技术应用于辅助生殖植入前/产前/产后先天性疾病诊断的初步应用,浙江大学医学院附属妇产科医院,1,出生缺陷,出生时就有外表的、内部的结构异常或功能异常我国出生缺陷率达5.6%每年新增出生缺陷约90万例日益成为突出的公共卫生问题和社会问题,2,出生缺陷,3,出生缺陷干预-关注生殖全程,高危人群目标人群,产前诊断,孕前诊断,不孕人群,精子,产后先天性疾病诊断,卵子,+,胚胎,胎儿,新生儿、儿童,4,对胚胎或卵子行卵裂球或极体活检，作染色体和/或基因学检测，将无疾病胚胎植入子宫妊娠，并出生正常子代的技术辅助生殖与遗传学技术相结合的一种产前诊断方法关键点是建立单细胞遗传诊断技术,孕前诊断-植入
2、前遗传学诊断技术(preimplantation Genetic Diagnosis,PGD),5,染色体疾病的诊断,在人类染色体研究历史上,研究者一直致力于利用可视化的显微镜分析染色体的完整性除了非整倍体，染色体微缺失、重复、扩增和等基因组DNA失衡是导致胎儿发育迟缓、畸形、死胎、流产和其他先天性疾病的内在原因,6,是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术,传统核型分析技术,绒毛活检取材 孕中期羊膜腔穿刺羊水 细胞培养 染色体核型分析,对非整倍体和重大染色体结构异常诊断的准确率达到99%,7,局限性,材料受限，需要新鲜的组织、血样进行活细胞培养不能分辨长度在10Mb以下染色体片断的缺失、增加或易位
3、染色体亚端粒区域异常诊断率较低,单细胞分析 高分辨率分析,8,荧光原位杂交技术（fluorescent in-situ hybridization，FISH),可对相应位点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断 提高了染色体异常的诊断精度FISH探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交-无需细胞培养，可用于单细胞分析,Chromosome 13q13-14,Chromosome 21q21,荧光标记的DNA探针,中期分裂相,间期细胞核,9,FISH局限性,只能对有限的位点进行检测 FISH依赖于探针的设计，检测不明原因的病例难度较大对植入前胚胎的检测，缺乏覆盖全基因组检测的能力,
4、10,FISH for structural aberrations,2-colour FISH,3-colour FISH,11,比较基因组杂交（comparative genomic hybridization,CGH),1：1混合杂交于同个正常男性中期分裂相,Cot-1 DNA,双色荧光强度比分析,正常 DNA,病人 DNA,Gain,Loss,LOSS,Gain,12,1：1混合杂交于芯片（BAC.Oligoarray，SNP),Cot-1 DNA,计算机扫描，数据分析,病人 DNA,正常DNA,Gain,Loss,微阵列比较基因组杂交技术（Array Comparative geno
5、mic hybridization，aCGH),13,14,aCGH优势,结合了基因芯片和传统CGH的优点更高的分辨率：G-显带的分辨率：10Mb 传统CGH:5-10Mb Array CGH:100kb检测基因组的拷贝数变化，可对染色体非整倍体、微缺失或微重复或其他不平衡的染色体异常检测能够对染色体异常进行精确定位结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测-PGS/PGD,15,16,用于检测CNV的染色体芯片（CMA)在下列情况应作为一线检测手段非已知综合症的多发畸形非综合症型的发育迟缓/智力低下孤独症谱系疾病进一步明确发育迟缓、语言发育落后和其他尚不明确遗传学病因的症状对于一些CM
6、A检出不平衡的病例，建议用细胞遗传/FISH进行确认，同时对父母进行临床遗传评估和咨询,17,The American Journal of Human Genetics 86,749764,May 14,2010,21698例不明原因发育迟缓、低智，孤独症，多发畸形芯片（CMA)检测：诊断率15%-20%核型分析：诊断率仅3%,发育障碍和智力低下等先天疾病首选CMA,18,截止2011年，智力低下的array CGH研究论文就达4370篇,19,CMA技术平台,Affymetrix 芯片平台 产前、产后检测,Bluegenome 芯片平台 植入前胚胎检测,20,CMA的应用,在辅助生殖临床上
7、进行全染色体范围的非整倍体筛查在反复自然流产原因分析补充产前诊断的一个重要手段在智力低下、发育迟缓和体征多种畸形儿童致病原因分析在儿童自闭症原因分析,21,高龄产妇复植入失败复发性早期流产严重的男性不育症父母为平衡易位、倒位携带者非整倍体是辅助生殖低妊娠率和高流产率的主要因素，PGS的目的是识别整倍体的正常胚胎转移，以实现增加怀孕的机会,CMA植入前胚胎遗传学筛查/诊断适应人群,22,CMA产前诊断适应人群,希望更全面、更准确的了解胎儿染色体情况，以排除出生缺陷的可能性（生长发育迟缓，智力低下、自闭症等原因）胎儿B超检查发现结构异常，但染色体核型分析正常者羊水染色体核型分析已发现异常，但无法确
8、定异常染色体的确切位置或来源者胎儿发现新发的染色体相互易位，需进一步排除微缺失者,23,CMA检测先天性疾病的适应症,不同程度的智力低下生长发育迟缓、语言发育迟缓面容异常内脏器官（如心脏、肾脏、生殖器）畸形认知/精神/行为问题（如多动症、自闭症）,24,截止12年10月，共收病人233例植入前诊断病例7例难免流产流产物分析121例产前诊断病例50例产后先天性疾病诊断55例,CMA检测病例,25,植入前诊断病例反复流产反复IVF失败父母为平衡易位携带者产前诊断病例新发平衡易位胎儿，排除染色体微缺失父母为平衡易位携带者B超诊断结构异常胎儿：脑部结构异常、先心、肾增大、单脐动脉、羊水过多、淋巴水囊瘤
9、产后诊断自闭症脑发育不全/智力低下先天性心脏病,26,检测标本,活检的单个卵裂球绒毛引产胎儿组织羊水脐血外周血,27,WGA,Array-CGH,Array-CGH results,SurePlex Bluegnome,24SureBluegnome,BlueFuse Multi,D3 Cleavage stage embryo,单细胞Array CGH过程,AneuploidyScreening(PGS),PGD Structural Chromosomal Abnormalities,28,用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)提取纯化DNABluegnome CytoC
10、hip Focus Constitutional芯片Affymetrix CytoScan HD&SNP 6.0Reference DNA:Normal Promega Male Normal Asian Male,检测主要试剂,29,主要步骤,30,后续验证主要方法,MLPAFISHPCR,多重连接探针扩增技术(MLPA),31,初步总结,植入前诊断病例6例病人，共32个胚胎进行了array CGH检测其中2例患者的所有胚胎检测结果异常，未获得可移植的正常胚胎4例患者得到可移植的胚胎，2例获得成功妊娠，目前已孕30周，继续妊娠中。,32,产前诊断病例核型含衍生染色体的羊水标本全部检出染色体的异常来源死胎或胚胎停育病例中46.9%检出了染色体拷贝数增加/减少，含16,15,21，22,18号等染色体的非整倍体，染色体拷贝数增加的片段包括4q13.2-q35.2，5p15.33，5p13.33，10q11.21，19p13.3-p13.2等，。B超诊断结构异常引产胎儿组织30.4%可检出有临床意义的染色体微缺失或微重复，其中大部分为常规染色体核型分析不易检出的病例,33,产后病例37.1%检出有临床意义的染色体微缺失、微重复，检出拷贝数减少的染色体片段包括15q11.2，15q13.1，5p15.33-p4.3，11p11.2，5q11.2，16q23.3等,34,
