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1、 微生物技术综合实验红茶菌膜菌种的筛选和制作 指导老师：王冬梅 系别：生物与化学工程系专业：生物工程班级：03151 姓名：马伟强学号：15203052同组成员：李洪兴 方文 杨云文 陈岭 南阳理工学院生化系 2005.122006.1 目录一摘要。二关键词。三正文。31文献综述。 32实验目的。33实验仪器、材料。 34实验步骤。341 高产酵母菌的选育。342 高产醋酸菌的选育。343 高产乳酸菌的选育。344 红茶菌的制作。35讨论及分析。四参考文献。 一、摘要红茶菌，俗称海宝，是一种传统的活菌饮料，其味酸甜爽口，遍及世界几十个国家研究表明，红茶菌是由醋酸菌、乳酸菌和酵母菌形成的共生菌，
2、它能调整人体的某些生理功能，增强体质，具有良好的抗菌能力，无毒性，因而深受人们喜爱本文试从自然界中分离出红茶菌含有的醋酸菌、乳酸菌和酵母菌，对其进行纯化，然后通过诱变及定性的发酵实验选育出高产菌株。最后将三种高产菌株按不同的配比接入红茶糖水（红茶：糖：水=0.2:5:200）中,培养5-7天,观察培养液的色泽,口味,及菌膜的厚度,找出最佳配比,制作红茶菌膜菌种.Abstract： The black tea fungus, whose popular name is haibao , is one kind of traditional live fungus drink.The taste
3、of it is both acid and sweet ,so it is very delicious and prevalent through nearly one hundred countries. Research indicates that the black tea fungus is symbiotic microbes including the acetic acid fungus、the lactic acid fungus and the saccharomycetes , it can adjust certain physiological functions
4、 of the human body, enhance the superiority of the mans health.The black tea fungus is non-toxic and has a greatful antibacterial ability, thus it is deeply loved by so many people. In this article we try to separate from the nature the three kind of microbes: the acetic acid fungus、the lactic acid
5、fungus and the saccharomycetes that are contained in the black tea fungus.Cluture them in good conditions ,and then carry out some fermentation test after mutagenesis. Though the fermentation test the excellent productive strains of each of three fungus was selected. Finally ,inoculate the three kin
6、ds of productive strains according to different allocated proportion into the culture solution turns (which is made from the black and sucrose, the black tea: Sugar: Water =0.2:5:200), raises for 5-7 day, the colour 、 taste and the morphology (the thickness of the symbiotic microbes membrane) is obs
7、erved. Then find out the best allocated proportion to make excellent spawn of the symbiotic microbes.二、关键词（Key word）发酵茶 fermentation tea 红茶菌black tea fungus 酵母菌saccharomycetes 醋酸菌acetic acid fungus 乳酸菌lactic acid fungus诱变 mutagenesis 分离isolation三、正文31 文献综述3.1.1红茶菌研究历史提到神奇的红茶菌，大家也许有点“丈二和尚摸不着头脑”，因为作为一
8、种养生健身饮料，红茶菌对大家来说并不十分陌生，可是它却有着不同寻常的身世。红茶菌汤是一种从先秦时期起就在我国民间流传的家制饮料，具有提神解毒作用，有“神茶”的美名。在东晋末年，为了给倭国赞王医治消化不良症，红茶菌经朝鲜传入日本。在19世纪初，红茶菌又被东亚商人带到沙皇俄国。俄罗斯人称红茶菌汤为茶叶酸酒（茶科瓦斯）。后来红茶菌又经沙皇俄国传遍欧洲。在上世纪80年代初期，红茶菌饮料曾经红极一时，被推崇为能医治百病的万灵药。这种过分的夸大宣传自然经不起时间的考验，红茶菌饮料很快就被人们遗忘了。但是，红茶菌饮料能从先秦流传到现在，除了它的味道醇香、酸甜可口外，其保健功能也起了重要的作用。从1852年起
9、，在欧洲就开始了对红茶菌汤功能的研究。20世纪初，在俄国就有饮红茶菌汤能减轻头痛和胃病的报道。第一次世界大战期间，红茶菌汤在欧洲被誉为俄国人的家制秘药，这种神奇的饮料对调节士兵经常发生的肠道功能失调特别有效。前苏联中央肿瘤研究所与俄罗斯联邦科学院在1951年进行的流行病学研究发现，每天饮用红茶菌汤具有很好的抗癌作用。在20世纪60年代进行的研究再一次证明，红茶菌汤有治疗癌症和解毒作用，长期饮用能提高免疫力和促进干扰素的产生。施塔伊克劳斯等人在1996年报道，红茶菌汤的抗幽门螺旋杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肿胀脓杆菌作用主要是来源于发酵过程中生产的醋酸。3.1.2红茶菌饮料的近期发展最近，我
10、国科学家运用现代生物工程技术研制出了“红茶菌”茶饮料，以茶叶、低聚糖等为主要原料，最大特色是发酵型纯天然，不加任何香精和酸味剂。 专家介绍，现代“红茶菌”是由三种有益于人体健康的益生菌，即醋酸菌、酵母菌、乳酸菌组成的共生体系，它们通过自身特殊作用，将茶叶等原料经过生物技术发酵工艺转化为极其丰富的营养物质，并赋予一种酸甜相宜、清香爽口的风味。日本科学家坂田正义潜心研究多年后认为，常饮红茶菌，具有益于清理肠胃；降低血糖、血压；有益于肝肾、排结石；有益于清肺、止咳、平喘；清心安神；抗衰老；抗癌症等七大好处。美国营养专家也认为，红茶菌对血压具有双向调节作用，还能够提高T细胞数量，增强机体的免疫力，对关
11、节疼痛、白发也有一定的功效。20世纪70年代曾经风靡一时，当时民间把红茶菌视为能治百病的神茶，吃了红茶菌，有的高血压患者血压能保持稳定;有的萎缩性胃炎显著好转;有的长期饮用便秘消失，更多的人饮用后感到精神充沛、疲劳消除、皮肤滋润、增强抗病能力,益处匪浅.3.1.3红茶菌的功用与组成在民间被称为海宝（在有些地方也叫胃宝）的红茶菌是醋酸菌、乳酸菌与酵母菌的共生体，在用加糖茶水培养的过程中，随着菌体的生长，茶水也逐渐变酸。根据化学分析，已知发酵液的主要成分为醋酸、乳酸、D葡萄糖酸、葡萄糖酸内酯、2羰基D葡萄糖酸、D葡萄糖二酸、地衣酸、乙醇和甘油。红茶菌汤的多数功能也是来自它的酸性成分，红茶菌汤的解毒
12、作用是由于葡萄糖醛酸能与毒素结合，有利于毒素排出体外，由毒素在体内积累引起的痛风和肾结石能以这种方式使症状得到缓解；重金属或环境污染物质在人体内也可以通过葡萄糖醋酸化由肾排出体外。不过目前对这一解毒过程还有争论，还有待做进一步的研究。既然它对人体有这么多的好处，那么红茶菌到底是一种什么东西？微生物学的研究揭开了这些秘密。红茶菌培养物中，含有大量醋酸菌、酵母菌和乳酸菌。其中又以醋酸菌和酵母菌为主。红茶菌中的酵母菌，主要是啤酒酵母，醋酸菌则主要是胶膜醋酸杆菌，乳酸菌主要是乳酸杆菌。此外，酵母菌中所含的酵母葡萄糖、无机盐以及VB、VE对人体具有很强的营养作用，特别是酵母菌的细胞壁能产生一种叫做B古鲁
13、千的物质，这种物质是当今世界各国公认的治癌抗癌物质；醋酸菌能吸收酵母菌分解出来的酒精，并分泌醋酸酶，把酒精氧化成醋酸和水，同时放出热量，使得人体内的营养得到充分利用，促进新陈代谢，抑杀肠道内有害细菌；乳酸菌的存在破坏了细菌的生长环境，使细胞在偏酸的情况下生长受到抑制，直至死亡，乳酸菌具有抑杀肠道内有害细菌，增强人体抵抗病毒的能力。因此筛选性发酵能力高的菌株具有很好的应用前景。3.1.4 红茶菌的食用机制红茶菌的菌膜，是个纤维网状结构，内含上述3个菌种。膜多时，可以食用，生食似海蜇皮，烹调后食则如鱼片（注：菌膜去酸，是先用水浸洗，并加热以脱去酸味，最后再侵入风梨糖浆中煮沸，即可由强韧菌膜变成柔软
14、如洋菜或豆腐状）。红茶菌虽价廉，但具人参、鹿茸等补益之效，能益寿延年、抗老保健，而且能治疗多种疾病。红茶菌是自己能够培养的良茶，又十分可口，这是其它保健药所不及的。常饮红茶菌能治病强身保健康。 红茶菌是集饮用,药用,食用为一体的复合菌群。红茶菌发酵液中,含有30多种营养物质和人体不可缺少的八种氨基酸.。红茶菌体呈海蜇状，表面光滑.红茶菌培养液可直接饮用,味似酸梅汁,果香气浓郁,酸甜适宜.红茶菌自身抗菌,杀菌力强,菌体发酵快,酸化程度高,培养技术简单,容易进入千家万户.红茶菌富含乳酸菌,酵母菌,醋酸菌,有机酸,糖类,维生素B、C氨基酸及其他共三十多种对人体有益的营养物质.具有强身,美容,益寿三大
15、功效,在中国民间广为流传，名扬四海。3.1.5红茶菌的研究意义红茶菌饮料为营养保健珍品，不但酸甜可口，而且清凉解热，独具风味，冠压群芳。中国苗乡红茶菌（海宝、胃宝）,名扬四海，它内含乳酸菌、醋酸菌、酵母菌、茶、糖、维生素等约二千种天然营养物质，其菌母晶莹透亮，茶饮金黄飘香，用茶水和白糖再加上红茶菌菌种培养能自然生长变大，它比其它酸性饮料营养更丰富，保健医疗功效更多，副作用更小，被专家誉为“饮料王”，是世界罕见的营养保健自产自饮珍品。由于红茶菌具有营养、预防、保健、医疗、康复五大功效，又能防治癌症、心脏、脑血管、肠胃、肝肾、肥胖、斑秃等28种疾病，红茶菌不仅味道酸甜可口，如柠檬汁、杨梅汤、男女老
16、幼有常饮不厌之感，因而它功效卓著，优于目前的微生物药剂。国家科委、全国新产品新技术办公室均列为98重点计划推广项目， 红茶菌生物工程的科技论文载入世界名医文献库、英国世界名医论文经典。红茶菌由于富有以上多种有益于人体的微生物，经常饮之，确实能起到防病治病、延年益寿的保健作用，因而被称为奇茶。3.1.6红茶菌饮料的市场分析1、茶饮料市场中国国内茶饮料虽然起步较晚，但发展却极为迅速，短短几年内，便由起步阶段迈向高速发展期。1997年全国茶饮料生产仅20万吨，1999年即达200万吨，增长了l0倍。虽然冰茶仍占主导地位，但所占比列已经开始下降，纯茶比例明显上升，这与消费者所倡导的纯天然、保健型的绿色
17、饮料的趋势是一致的。从目前整个饮料市场采看，茶饮料所占比例仍比较小，人均则更少，茶饮料在中国的市场潜力非常巨大。就国际饮料发展情况来看，纯茶饮料也是茶饮料发展的一个主要方向，市场前景十分广阔。2、红茶菌饮料市场依靠着茶饮料在国内和世界市上的迅速发展，红茶菌饮料做为一种绿色的茶饮料也在世界经济的发展中占据了一定的席位。21世纪的发展方向为绿色和环保，于是红茶菌饮料做为目前来说最为合格的绿色茶饮料闪亮登场。尽管目前来说，红茶菌饮料并没能代替传统饮料在人们饮食结构中的地位，但是随着时间的推移它就会越来越贴近我们的生活，并依赖其保健及药用功能占据饮料的主流。32实验目的3.2.1 红茶菌基本菌的筛选红
18、茶菌是由酵母菌、醋酸菌、乳酸菌三种基本微生物组成的，故先在自然界用各自分离筛选培养基筛选出三种菌株，然后用紫外线进行诱变筛选出高产菌株。3.2.2红茶菌的制作红茶菌是有以上三种微生物按照不同比例混合，以发酵茶产生速率，菌膜厚度和风味.色泽为衡量标准，挑选出发酵速率快而且菌膜厚且透明度高，风味独特，口感好，色泽纯正的为合适菌株，纯化保藏。33实验仪器、材料331仪器ldzx-401型立式自控电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂GNP-9080型隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司DHG-9146型电热隔温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司721分光光度计 上海国营长江科学仪器厂85-1
19、磁力搅拌器 江苏医疗仪器厂XSP-3C型单筒显微镜；超净工作台、电子天平、剪刀、培养皿、试管、白瓷盘、白瓷缸、玻璃棒、酒精灯、接种环、三角瓶、吸管、摇床332材料出发菌：土壤梯度稀释溶液取5g土壤(自然界土层表面2CM以下新鲜土壤)，放在装有45ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，摇匀，洗取1ml于9ml的无菌水试管中即稀释倍数为10-1，逐级稀释到10-2，10-3.10-6，10-7。34实验步骤 341 高产酵母菌的选育1. 酵母菌的分离和纯化1.1 材料:土壤梯度稀释溶液培养基：酵母菌分离培养基：10 g大麦芽粉65度糖化，经碘化钾试纸检验，试纸不变蓝 .琼脂10g.蒸馏水500ml酵母菌选
20、择培养基：酵母膏 5g .蛋白胨 10g .葡萄糖 10g .琼脂 10g .蒸馏水 500ml1.2 酵母菌分离筛选流程：土壤溶液稀释选择性培养镜检纯化斜面保藏1.3 具体步骤 1.3.1 将各种稀释梯度的菌悬液各取1ml，注入盛有分离培养基的培养皿中，每个稀释梯度做两个平板，置于30度下生长2d3d，观察菌落的形态。1.3.2 挑选6个乳白色，圆形，表面光滑，大且厚的菌落进行镜检。镜检结果如表一:表一 酵母菌特征和镜检结果菌株形状边缘表面色泽隆起镜检形状（16*40倍）芽孢染色（16*100油镜）1#圆形不整齐光滑乳白微凸腊杆状可见绿色芽孢2#圆形整齐光滑乳白微凸球状可见绿色芽孢3#圆形整
21、齐光滑乳白隆起球状可见绿色芽孢4#圆形整齐光滑乳白平坦球状可见绿色芽孢5#圆形不整齐光滑乳白微凸腊杆状可见绿色芽孢6#圆形不整齐光滑乳白隆起椭球状可见绿色芽孢以上六个单独菌落，挑选出菌落特征比较明显的3#进行斜面培养1.3.3 酵母菌种的纯化取2环菌种，置于10ml无菌水中即为10-1，逐级稀释到10-3各取1ml菌液，注入盛有分离培养基的培养皿中，培养2d，观察菌落形态，根据生长状况结合镜检筛挑选出单菌落酵母菌菌株。同时将以上单菌落转接到装有选择培养基的试管斜面培养，待用2. 酵母菌的诱变2.1原理:紫外线主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的嘧啶形成二聚体，从而引起突变。2.2
22、具体步骤:2.2.1 取培养48小时的丰满酵母菌斜面，用10ml左右的无菌生理盐水洗涤，用接种针轻轻刮两次，再倒入放有磁针的无菌的三角瓶中，将其在磁力搅拌器上搅拌30s。2.2.3 将选择培养基融化，倒27个平板凝固后待用。2.2.4 将紫外线开关打开预热20min，取直径9CM取的平皿两套，分别加入上述菌液5ml，并放入一跟大头针。将上述两套平皿先后放在磁力搅拌器上，打开板盖，在距离为30cm功率为30W的紫外灯下照射20s 和35s，盖上皿盖，关闭紫外灯。2.2.5分别取1ml菌液，逐级稀释成倍数分别为10-1，10-2.10-6酵母菌种悬液。每个稀释度涂三个平板，每套平板加稀释菌液0.2
23、ml用无菌涂棒均匀的涂满整个平板表面。同样的操作，取未经紫外线诱变的稀释菌液涂布作为对照。2.2.6将以上平板放在暗箱中，30度下培养24h。2.2.7分别挑选20s和35s中菌落圆形，乳白 ，大且厚，表面光滑的各三个进行试管斜面培养.同样在未诱变的对照组中挑选一个菌落进行斜面培养.3. 高产酵母菌选育3.1酵母菌发酵能力的测定3.1 .1 由于表观糖度直观的表现出了发酵速率，通过糖度的测量其外观糖度，得出起发酵速度3.1.2 取待测的7支菌株，分别接一环于装有20ml 3.5BX 的麦芽汁的试管中，在25度恒温培养24小时。3.1.3以上试管的军种分别接入装有350ml 3.5BX的麦芽汁的
24、小三角瓶中，经过四天发酵. 酵母菌发酵液的表观糖度如表二 表二 酵母菌发酵液的表观糖度1#2#3#4#5#6#7#表观糖度（BX）1.41.91.92.21.82.42.03.2 选择高产菌株由此可见发酵能力1#最大， 6#最小 。故选取1#酵母菌菌株置于装有酵母菌选择性培养基的试管斜面活化保藏，作为后续红茶菌的组成待用。342 高产醋酸菌的选育1. 醋酸菌的分离和纯化1.1 材料:土壤梯度稀释溶液培养基:分离培养基：葡萄糖 10 g、酵母膏 10 g、碳酸钙 20 g、琼脂 15 g、蒸馏水 1000 ml、PH=6.8选择培养基：葡萄糖50 g、酵母膏 10 g、琼脂 5 g、蒸馏水 10
25、00 ml1.2 醋酸菌分离筛选流程：土壤稀释液稀释分离产醋酸定性试验初筛复筛斜面保藏1.3 具体步骤:1.3.1 吸取土壤梯度溶液10-4、10-5、10-6浓度，取各浓度稀释液0.2ml，用涂布法接种于醋酸菌分离培养基平板上，30培养48h.1.3.2 在葡萄糖、酵母膏培养基上菌落呈油脂状，颜色灰白，表面隆起平滑，边缘整齐，培养基内不产生色素, 挑取透明圈大、菌落丰厚且占生长优势的单菌落进行镜检。1.3.3 革兰氏染色原理：革兰氏染色是建立在由于革兰氏阴性和阳性细菌间细胞壁结构及化学成分的不同所引起的差异上的。革兰氏阴性菌的细胞壁富含类脂质，面肽聚糖含量很少，酒精可穿过细胞壁，溶解结晶紫碘
26、液，使细胞保持无色。相反，革兰氏阳性菌细胞的细胞壁含有大量 的肽聚糖，脂肪含量则很少，因此，肽聚糖的厚度及酒精对它的水解使洒精不能进入细胞，从而使细胞保持由结晶紫碘液染成的紫色或深蓝色。操作：标本涂片的制备：取一滴无菌生理盐水放在洁净的载玻片上，用接种针或接种环直接从醋酸菌固体培养基上取出小环菌落菌体，在生理盐水中混匀，自然干燥，在火焰上固定2-3次。冷却后，进行染色。染色：在已固定的标本涂片上滴几滴结晶紫溶液，反应2分钟后用水冲洗。滴1-2滴路哥氏碘溶液，反应30秒后用水冲洗，并用滤纸吸干。滴几滴蕃红复染液，反应10秒钟后用水冲洗，并用滤纸吸干。用油镜观察。结果：细胞短杆状，染成红色,革兰氏
27、阴性，成对或成链,初步认定此细菌为醋酸菌。1.3.4 产醋酸定性试验：将上述斜面菌种分别接种于含3%（V/V）乙醇的基础培养基中，30静置浅层培养72h后，取5ml除去菌体的培养基，以2.5mol/lNaOH溶液中和至PH7.0，加入5%FeCl3溶液56滴，形成红褐色沉淀者为产醋酸细菌。1.3.5初筛：把以上分离得到的单菌落菌株，在碳酸钙平板培养基上进一步分离、培养，继续观察确认是形态一致的单菌落后，根据其透明圈直径与菌落直径之比的HC值大小进行初筛，将HC值明显大于其他菌株的单菌落菌株筛选出来，进行下一步复筛试验。1.3.6复筛：将上述初筛菌株分别接种于分离培养基，于30静置浅层培养。把此
28、复筛后的菌株做为始发菌株。2. 醋酸菌的诱变2.1原理及流程:紫外线主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的嘧啶形成二聚体，从而引起突变诱变筛选流程：始发菌株紫外线诱变处理分离纯化产醋酸定性试验初筛复筛菌种鉴定斜面保藏2.2 具体步骤:2.2.1取培养48小时的丰满醋酸菌斜面，用10ml左右的无菌生理盐水洗涤，用接种针轻轻刮两次，再倒入放有磁针的无菌的三角瓶中，将其在磁力搅拌器上搅拌30s。2.2.2将选择培养基（加入2%质量分数的碳酸钙）融化，倒27个平板凝固后待用。2.2.3将紫外线开关打开预热20min，取直径9 mm的平皿两套，分别加入上述菌液5ml，并放入一跟大头针。将上述两
29、套平皿先后放在磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm功率为30W的紫外灯下照射15s 和30s，盖上皿盖，关闭紫外灯。2.2.4分别取1ml菌液，逐级稀释到10-4、10-5、10-6浓度的醋酸菌种悬液。每个稀释度涂三个平板，每套平板加稀释菌液0.2ml用无菌涂棒均匀的涂满整个平板表面。同样的操作，取未经紫外线诱变的稀释菌液涂布作为对照。2.2.5将以上平板放在暗箱中，30下培养24h。2.2.6分别挑选15s和30s中菌落圆形，灰白 ，菌落大且丰厚，透明圈直径与菌落直径之比的HC值大的菌落各三个进行试管斜面培养.同样在未诱变的对照组中挑选一个菌落进行斜面培养.2.2.7菌种鉴定：细胞短杆状
30、，革兰氏阴性，成对或成链。在葡萄糖、酵母膏培养基上菌落呈油脂状，颜色灰白，表面隆起平滑，边缘整齐，培养基内不产生色素。2.2.8分离筛选：诱变处理后的分离纯化、初筛和复筛等操作同前述方法。3. 高产醋酸菌选育3.1醋酸菌发酵能力的测定产酸量的测定：在始发菌株、诱变15 s的菌株和诱变30 s的菌株试管中各挑取2环分别接入盛有10 ml液体培养基的7个试管中，加入3滴0.5 %酚酞试剂，用标定的0.1 mol/lNaOH溶液滴定至浅粉色。由耗用的NaOH溶液的体积计算样品中的含酸量（以醋酸计）。结果如表三表三 三种菌株的产酸量结果 g/l菌株号始发菌株诱变15 s的菌株诱变30 s的菌株1#2#
31、3#4#5#6#7#产酸量3.2 选择高产菌株表三结果表明：经诱变筛选后的产酸量明显高于始发菌株的产酸量，其中产酸量最好的菌株是343 高产乳酸菌的选育1. 乳酸菌的分离和纯化1.1 材料:土壤梯度稀释溶液培养基:乳酸菌的分离培养基：MRS培养基蛋白栋10.0g 酵母提取物5.0g 酵母膏10.0g 吐温80 1ml 葡萄糖 20.0g K2HSO4 2.0g MgSO47H2O 0.25g 乙酸钠 5.0g 柠檬酸二铵2.0g 0.2%溴甲酚紫 1ml 蒸馏水 1L 调PH 6.26.4乳酸菌培养基牛肉膏5g 酵母膏5g 蛋白胨 10g 葡萄糖 10g 乳糖果5g 氯化钠 5g 水1000m
32、l 121摄氏度湿热灭菌20min PH 6.8蛋白胨水培养基：蛋白胨 10g 氯化钠 5g 水 1000ml PH 7.27.4 121摄氏度湿热灭菌20min糖发酵培养基：蛋白胨水培养基1000ml ,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液12ml ,PH7.6, 20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各 10ml制法：1)将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（PH：7.6）分装于试管中，在每管内放 一倒置的小玻璃管（Durhem tube）,使充满培养基。2)将已分装好的蛋白胨水培养基和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水培养基121摄氏度灭菌20min,糖溶液112摄氏度灭菌30min。3) 灭菌后，每管以无菌操作
33、分别加入20%的糖溶液0.5 ml ，则成1%的浓度。有关溶液：1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6g溶于100ml水中，贮存于棕色瓶中保存备用。 0.2%溴甲酚紫溶液：溴甲酚紫0.2g溶于100ml水中，贮存于棕色瓶中保存备用。 吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g ，95%乙醇760ml ，浓盐酸160ml1.2乳酸菌分离筛选流程：土壤稀释液稀释分离产醋酸定性试验初筛复筛斜面保藏1.3 具体步骤131 吸取土壤梯度溶液10-4、10-5、10-6浓度，取各浓度稀释液0.2ml，用涂布法接种于乳酸菌分离培养基平板上，28-30培养48h.132 观察在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培
34、养基变为黄色，取出少量在显微镜下观察其形态。133 革兰氏染色 原理与操作步骤如上 结果：细胞链球状，染成紫色,革兰氏阳性，初步认定此细菌为乳酸菌。134乳酸菌的鉴定实验吲哚实验：1） 试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管3支，分别标记乳酸菌和空白对照。2） 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24-48小时。观察记录：在培养基中加入乙醚12ml，经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的表面，此时沿管壁慢加入510滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。3）结果：加入
35、菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应。说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验为阳性。糖发酵试验1） 试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各3支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。2） 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。3） 观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性，培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应
36、。4） 结果：在加入葡萄糖的发酵培养液中加入菌种后，培养液变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡。加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡。证明该菌种能分解葡萄糖和蔗糖而产酸。杜氏小管内没有气泡，说明该菌种分解糖后不产气。也证明此菌种不是大肠杆菌，因为如果是大肠杆菌除了产酸反应结果为阳性外，而且杜氏小管内会有气泡，因为大肠杆菌具有分解葡萄糖和蔗糖产酸并产气的能力。135乳酸的检测 操作：选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵的上清液约10ml于试管中，加入10%硫酸1ml，再另2%高锰酸钾1ml，此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中浸泡的滤纸条搭在
37、试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。 结果：通过滤纸条变黑，说明有乳酸存在。因为在发酵的上清液中加入10%硫酸1ml和2%高锰酸钾1ml后，此时上清液中的乳酸转化为乙醛，另热后使乙醛挥发，因此使滤纸条变黑。以上种种特征均符合乳酸菌的特征。链球状的即为乳酸菌中的乳链球菌。136 挑选此菌株进行连续6次以上的传代，以达到提纯，同时将以上单菌落转接到装有选择培养基的试管斜面培养，待用。2. 乳酸菌的诱变21诱变原理及方法如上所述（诱变所用选择培养基加指示剂为0.2%溴甲酚紫）22 培养2-3天，选择其变色圈直径与菌落直径之比的HC值大的6个菌落进行扩大培养，同时也挑选空白对照中一个比较好的菌落
38、进行扩大培养（实验中对此7个菌落做标记）。然后进行下一步的性能测定。3. 高产乳酸菌选育31产酸能力测定：对经诱变筛选得出并扩大培养的6株菌种及空白对照菌种进行产酸能力测定，分别用接种针挑取少量菌苔接种到7个含乳酸菌选择培养基100ml的三角瓶中,恒温培养一天。然后各取等量的培养液用0.1mol/lNaOH溶液滴定，计录数据，按下式计算产酸能力，选取产酸能力最强的菌株。 NaOH +CH3-C-H -CH3-C-H +H2O40 90经计算，产酸量最强菌株0.81g/100ml 。32 将此产酸能力最强的菌株进行扩大培养。344 红茶菌的制作a) 母液的培养基的制作：红茶：蔗糖：水=0.2：5
39、：200 煮沸调制成1000ml的红茶水后，分装入经消毒后的5个三角瓶中，冷却到35度时，用四层纱布封口待用。b) 在红茶菌共生体中，含量以醋酸菌为最多，酵母菌次之，乳酸菌最少。 c)按照不同的菌种比例（以接种环为单位）将筛选得到的三种高产菌种接种到红茶菌母液培养基中，在35摄氏度的恒温培养箱中培养，用纱布封口，5d-7d后观察其特征，挑选最佳比例。表四 红茶菌的配比对照比例特征2：1：13：1：14：2：15：2：1原始红茶菌色泽产酸量膜厚度（cm） 以上三种菌种的配比顺序分别为醋酸菌：酵母菌：乳酸菌，由对照性茶发酵实验可得出( )为最佳配比。其他组的性质与红茶菌共生体的组成有关。四、参考文
40、献1高产醋酸菌的分离选育 臧晋 刘凤霞 中国酿造-1999年5期2. 啤酒酵母分离纯化选育 谢建中 酿酒科技 2000年第2期3乳酸菌的分离.鉴定和驯化 吴定，孙德坤，解光艳，赵先斌（安微农业技术师范学院，按微 凤阳 233100）1999-10-284发酵工艺学原理 英P.F.斯坦伯里. A.惠特克 著 中国医科技出版社 5现代生物技术丛书微生物制药 Pharmaceutics of Micobial Medicine, 吴剑波主编，张致副主编化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心6现代生物技术丛书生物工程下游技术，第二版，刘国诠主编，耿信笃、苏天升、夏其昌、张玉奎 副主编，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心。7生物反应工程原理（第二版）贾士儒编著，科学出版社。8微生物实验指导黄秀梨主编，高等教育出版社（chep）,施普林格出版社（springer）。9布洛克著，四川大学、武汉大学等译，微生物生物学，人民教育出版社1980。10微生物学实验教程祖若夫、胡宝龙、周德庆编著， 复旦大学出版社（Fudan University Press）。11北京医学院 北京中医学院 主编. 中草药成分化学. 北京: 人民工业出版社, 1977. 496497。12工业发酵分析 天津轻工业学院 华南理工大学等 编
