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1、项目研究意义目的：以高效液相色谱手性固定相法建立6种手性农药对映异构体的拆分及在动物组织中的残留分析方法，手性农药分别包括两种杀虫剂马拉硫磷和水胺硫磷、两种除草剂乳氟禾草灵和乙氧呋草黄及两种杀菌剂甲霜灵和己唑醇。通过口服和注射两种途径对大鼠和家兔进行手性农药对映体的选择性代谢行为研究。测定排泄物包括尿液和粪便、血样中对映体的含量及相对比值（ER值）随时间的变化情况，最终检测肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑等组织中农药对映体的含量及ER值并确定对映体的选择性代谢及残留行为，代谢产物通过质谱进行确证，探讨代谢机理。研究手性农药对映体在动物体内的选择性代谢行为能更加真实的反映相关农药污染对人类健康的影响，
2、为其污染治理、指导合理用药、制定相关的分析方法及残留限量等标准提供依据，将农药污染等副作用对人类的影响减至最小。关键词手性农药；代谢；选择性；动物（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）农药是防治病、虫、草、鼠害不可缺少的重要手段，为农业的增收作出巨大贡献，但是由于农药的大量使用，对环境造成了严重的污染，直接或间接地威胁了人类的健康。绝大多数农药是有机化合物，普遍存在着手性现象。在以往的研究中，通常不区分手性农药的对映异构体，正因如此，对农药的风险评估所依据的数据是不完全真实的。由于立体化学的发展,手性现象
3、已引起了人们的广泛关注，手性是指呈镜像而不重合的关系，如同人的左右手互为镜像但又不能重合。手性化合物中存在两种或以上不同构象的分子，这些分子以镜像关系成对的存在，互称为对映异构体。医药、农药等研究已深入到分子立体异构领域，尤其是在医药方面，主要表现在大量手性药物单一异构体的研究和使用上，很多手性药物对映体的性质已研究的比较清楚。在农药领域相关方面的研究相对滞后，手性农药的各种性质通常是以外消旋体的形式加以研究的，缺乏单一对映体的详细数据。手性农药对映异构具有完全相同的化学和物理性质，但在生物体系中可能存在截然不同的生物活性、毒性、毒理及代谢途径等，如具有一个手性中心的多虫畏、盖草能、敌草胺、甲
4、霜灵等生物活性主要集中于其中的1/2对映体，而另一个对映体几乎无效；通常生产的氯菊酯、速灭杀丁等只有1/4是高效体,其余3个则为低效或无效成分；氯氰菊酯、溴氰菊酯和丙烯菊酯等,仅1/8是高效体,其余的7个异构体则相对低效或几乎无效。在目前通常使用的农药中，约25具有手性，其中只有少数品种具有光学纯的商品，而且主要集中于菊酯类杀虫剂，绝大部分是以外消旋体的形式销售和使用。投入使用的外消旋体中的低效或无效异构体不仅不能有效地防治作物病虫草害，浪费人力物力，而且污染环境、降低农产品质量，还可能产生毒副作用，引起药害，严重影响了人类的健康。目前，通常通过直接测定农药对高等动物的毒性、毒理及体内代谢途径
5、等来评价对人类可能造成的影响，在这些研究中农药的手性特征往往被忽略，同时对映体间不同的毒性、毒理及代谢方式因而也被忽略。农药可以在使用过程中直接或残留于农产品、环境介质中间接的进入人体，由于人体内的很多酶、蛋白等都普遍存在着手性，是一个手性环境，因此手性农药对映体进入人体后可能存在着选择性的代谢行为。这种选择性表现在几个方面，一方面，农药外消旋体发生了构型转化，原本为1：1的两种对映异构体，经过代谢作用，某种对映异构体可能占有绝对优势；或者，光学纯异构体可能发生外消旋化或完全转化成另一种对映异构体；另一方面，其中一种优先被代谢成其它代谢产物，另一种则相对稳定而不被代谢或代谢较慢。目前在进行手性
6、农药的毒性毒理评价时，是将含有两种或两种以上对映异构体的外消旋体农药当作一种农药来处理，没有考虑到对映异构体的构型转化或优先代谢的特性，因此使得传统上对手性农药的风险评估是不可靠的，即在进行手性农药的毒性毒理评价时所得的数据是不真实的。这种对映体的代谢及转化行为使得对手性农药的研究变得更为复杂。研究手性农药对映异构体在动物体内构型转化或优先代谢等行为能够更真实的反映其对人类健康的影响情况，这种影响有几个方面的可能，第一，在以往认为毒性大、三致作用强、代谢缓慢的手性农药中，部分手性农药的副面作用可能是由非活性的对映体所造成的，而真正起作用或活性更高的异构体的副面影响相对要小的多，如早期使用的DD
7、T及其类似物。针对这种情况通过合成、生产及使用单一异构体会克服以往的缺点。第二，非活性或活性低的对映体优先被代谢或转化，从而降低了副作用，这种可能是人们所希望的，而且若能探知导致这种优先代谢或转化的原因，将对指导手性农药的不对称合成和光学纯手性农药的生产具有非常重要的意义。第三，一种异构体代谢转化为副面作用更强的另一种异构体，这种情况下其风险要比毒理毒性实验测得的结果高的多。但是目前有关手性农药的相关方面的研究还基本是空白，不能反映其对人类潜在的影响，因此进行手性农药在动物体的选择性代谢就显得十分重要。大量的科学试验表明手性医药在人及动物体内的代谢确实存在着立体选择性，如Omeprazole
8、在人体内R-体比S-体更容易代谢； Carvedilol 经选择性代谢后在人的血浆中S-体的浓度比-R体高，人体对nisoldipine S体的代谢比R-体快8倍,相关方向的研究非常多。对手性农药在动物体的选择性代谢行为的研究非常少，只是很少数的几篇报道，而且相关的报道主要是有机氯农药在动物体及人体内的选择性的残留情况，Kallenborn R 测定挪威河乌蛋中有机氯农药的污染，发现-六六六的（+）异构体过剩；Ulrich E M研究-六六六在老鼠中的代谢并发现在脑、血、脂肪等组织中分别具有不同的选择性。Tanabe S曾检测-六六六在鲸鱼体内对映体的相对含量，发现（+）-/（-）-异构体比值
9、在1.6-2.8之间，随个体不同而不同，原因是代谢能力的差异。Wakabayashi K 研究过从老鼠肝脏中提取的谷光甘肽S转移酶对杀冥硫磷具有立体选择性的去甲基代谢作用而产生S-体的去甲基杀冥硫磷。Skopp S 研究了四种毒杀芬类似物在老鼠中的选择性代谢，在肝脏等组织中发现了选择性的代谢。关于其他手性农药的相关研究基本未见报道。构成动物体的酶、蛋白、氨基酸、多糖等都具有手性，决定了动物体内的手性环境。当手性农药进入动物体内必定会受到酶系等很多生物因子的影响，对映异构体代谢等行为会发生复杂的变化。人们已认识到农药及残留农药的原体、代谢物对人类健康的影响，但由于手性农药的特殊性，其对映体的选择
10、性的转化及代谢行为还是一个人们比较陌生的领域，对映体污染还未引起普遍的关注。研究手性农药在动物体内的选择性代谢行为具有非常重大的意义。本课题拟选择常用的6种手性农药，马拉硫磷、水胺硫磷、乳氟禾草灵、乙氧呋草黄、甲霜灵和己唑醇，首先基于高效液相色谱手性固定相法建立其对映体的手性拆分方法及在动物组织中的残留分析方法，进行其在动物体内的选择性代谢和残留行为的系统性研究。国际上至今尚未开展手性农药在动物体内的选择性代谢的系统研究，因此本项目的研究意义在于：（1）开展手性农药选择性转化、代谢、残留的系统研究工作，填补这一领域的许多研究空白；（2）发展相关农药的手性分离和代谢分析方法；（3）通过对手性农药
11、在动物体内的选择性的代谢、残留行为研究及机理探讨，对相关手性农药的生产、使用、手性农药法规的制定提出建设性的意见；（4）为相关手性农药的风险评估和污染治理提供依据，指导合理用药，减少污染，降低对人类健康的影响。主要参考文献1 R. M. Orlando, P. S. Bonato. Journal of Chromatography B, 2003，795：2272352 M.P. Marques , N.A.G. Santos , E.B. Coelho , et al. Journal of Chromatography B, 2001，762 ：87953 F. Behn , S. Mi
12、chels , S. Laer , et al. Journal of Chromatography B, 2001，755：1111174 K. Wakabayashi, M. Hizue, H. Nozaki, et al., Journal of Pesticide Science,1994, 19（4）：277-284 5 R.Kallenborn, S.Planting, J. E.Haugen, Chemosphere. 1998, 37: 2489-2499 6 S. Skopp, M. Oehme, H. Drenth, Chemsphere, 2002, 46: 7, 108
13、3-10907 E. M. Ulrich, K. L. Willett, G. A. Caperell, et al. Environmental Scidence and Technology, 2001, 35: 8, 1604-1609, 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究内容（1） 基于以往对数十种手性农药的分离、分析基础，利用高效液相色谱手性固定相法建立并优化6种选定农药对映异构体的手性分离、分析方法。（2）建立选定手性农药对映体残留于动物组织中的提取、净化及检测方法。（3）对试验动物进行饲养， 通过饲喂和静脉注射两种途径进行所选农药的代谢研究，对喂养和注射农药
14、的浓度进行试验筛选。（4）测定排泄物包括尿液和粪便、血样中对映体的含量及相对比值（ER值）随时间的变化情况，最终检测肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑等组织中农药对映体的含量及ER值并确定对映体间的转化、选择性代谢及残留行为。（5）通过质谱确证代谢产物。（6）进行同一种动物对不同手性农药及同一种手性农药在不同动物中的选择性代谢行为的系统研究，加以比较，探讨代谢机理。研究目标：（1） 建立所选定的6种手性农药对映体的分离分析方法；（2） 建立手性农药对映体在动物组织中的残留分析方法；（3） 测定手性农药对映异构体在动物体内的变化趋势，研究手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及残留行为；（4） 通过
15、对不同的手性农药对映体在不同动物体内及不同的组织中的选择性代谢行为差异的比较，探讨选择性转化、代谢及残留机理；（5） 为制定手性农药相关的法规提供依据，指导合理用药，提高安全性，减少污染。拟解决的关键问题： (1) 手性农药光学对映体的分离。由于对映体具有相同的物理化学性质，将其分离一直是相关研究的难题。结合以前手性农药的拆分基础，建立选定手性农药的分析方法，即ER值的测定方法，是进行手性农药对映体残留行为研究的基础。 (2)手性农药使用浓度的确定、测定样本的收集。由于研究对象是活体的动物，农药使用的浓度若太高会导致死亡，若太低则检测困难；其尿液、粪便、血样的收集相对较麻烦。(3) 动物组织中
16、的手性农药的提取、净化和检测。本项目检测残留于动物组织的手性农药要依赖于高效液相色谱法，与传统主要用于残留农药分析的气相色谱法（GC）相比，对提取、净化尤其是检测方法的要求要高的多。(4)机理讨论。3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）（1） 在以往研究和文献的基础上，合成并优化合适的手性固定相，利用高效液相色谱法发展建立所选手性农药对映体的分离分析方法；至目前为止，已用纤维素、淀粉等衍生物手性固定相直接拆分了百余种外消旋体化合物，而其中近50种化合物的拆分此前尚未见报道，我们已经成功的拆分了20余种手性农药并建立了相应的分离分析方法。（2） 参
17、考传统农药的残留分析方法，发展手性农药在动物组织中残留的提取、净化方法。我们所在的实验室是国内最早开展农药残留研究的单位。在几十年的相关研究中，已经积累了大量的农药残留采样、制备、保存、提取、净化、检测和确证方法。本研究的重点分析数据是手性农药对映异构体的相对比值（ER），试验中可通过样本富集、高效液相色谱法检测等手段获得蔬菜中残留手性农药的ER值。（3） 饲养试验动物，待达到一定重量以后选择健康状态良好的个体进行试验。参照已有的相关农药的毒性数据及试验确定用药的浓度，对于水溶性差的农药辅助于乳化剂饲喂或注射。将试验动物分组，喂药的老鼠每组6只，包括两个平行重复，每个平行重复3只（考虑到通过口
18、服方式进入所研究的样本中农药的浓度较低，将平行中3只动物的待测组织分别合并，提高农药的含量），注射农药的老鼠和家兔每组3只，即3个平行重复，每个平行1只，这样可以考察个体之间的差异性。饲养喂药和静脉注射都设6组试验动物，同时设空白对照，喂药后选择适宜的6个时间间隔点收集待测样本，包括尿液，粪便，血样，肌肉，脂肪，心脏，肝脏，脑。（4） 依据建立的样本处理方法及分析方法检测对映体的绝对和相对含量，从而测定对映体的代谢动态及其在各个组织中的对映体的立体选择性，据此来进行手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及其它残留特性的研究。（5） 通过质谱测定所产生的代谢产物，进行定性分析，从而探讨手性农
19、药的代谢机理。4、本项目的特色与创新之处。（1） 部分选定手性农药的对映异构体拆分研究目前尚未见报道；（2） 手性农药对映体的代谢研究目前国内外还未见有系统的研究，其用药、样品收集、样品中手性农药的提取、净化和检测分析还未建立完善的方法；（3） 研究手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及选择性的残留行为的新颖性；（4） 动物对手性农药对映体的选择性的代谢、转化等研究是一崭新的领域，缺乏成熟的试验方法，许多假设、理论都需要更多的相关实验研究来验证和发展。不同种手性农药在不同动物体内及不同组织中的选择性的代谢、转化、残留行为的系统研究、差异比较、机理探讨，目前在国内外尚未见报道；（5） 依据
20、手性农药对映体的代谢数据，重新认识相关农药的特性，提供更真实的手性农药毒性毒理数据以及有利于人类健康的用药策略。5、年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）（1）2005年度：查阅有关资料，在以往研究和文献的基础上，发展、建立、优化8种选定手性农药对映体的分离、分析方法；（2）2006年度：完成手性农药对映体在分析样品中的残留分析方法的建立，进行6种手性农药对映异构体在老鼠体内和2种农药在家兔体内的选择性代谢及残留行为等的研究；（3）2007年度：完成另外4种手性农药在家兔体内的选择性代谢及残留行为等研究，比较在各个组织中对映体的代谢动态及ER值，探讨
21、代谢机理。进行项目报告总结，发表相关研究论文。预期研究成果（1） 建立多种手性农药对映体的分离分析方法；（2） 建立手性农药对映体的代谢分析方法；（3） 测定手性农药对映体在所选动物体内的选择性的转化、代谢、残留行为；（4） 探讨手性农药对映体在动物中的选择性代谢机理；（5） 为相关手性农药的风险评估及其污染治理提供真实可靠的依据，为其生产提出建设性的意见，减少相关手性农药对人类健康的影响；（6） 在国内外重要学术刊物上发表相关研究论文812篇，完成博士论文2篇，硕士论文1篇。（二）研究基础与工作条件1、 工作基础本项目申请者多年来一直从事手性化合物的分离分析及农药残留分析的研究工作，在以往的
22、研究中，合成并制备了多种手性固定相，其性能以基本达到国外同类产品水平，利用这些自制手性柱已成功的直接拆分了百余种外消旋体化合物，而其中近50种化合物的拆分此前尚未见报道。特别是近几年来，从事了大量的手性农药分离及农药残留分析的工作，主持并参与了多项研究项目，这些项目涉及农药质量控制、农药残留分析等内容。申请者在近5年内发表相关研究论文60余篇。 项目申请者所在的中国农业大学理学院设有农药学科点，本学科点1988年被评为国家级重点学科，1996年被列入“211工程”重点建设学科，2002年再次被评为国家级重点学科。本专业拥有“农药化学及农药使用技术农业部重点开放实验室”，为本项目的完成提供了强有
23、力的保障。农药分析与环境毒理教研室几十年来一直从事农药残留分析的研究工作，多年来承担了与农药残留分析有关的国家自然基金项目、国际合作项目以及横向开发项目数十项，发表相关研究论文百余篇。多年的研究工作使得本教研室在农药残留分析方面积累了丰富的经验。这些农药残留分析工作既涉及到了环境（如土壤、水、大气）中的农药残留分析，也涉及动植物等农产品（如蔬菜、水果、粮食、肉、脂肪等）中的农药残留分析。 本项目的参加者均为本室的工作人员，多年从事手性农药分析及农药残留分析的工作，这是本项目能够顺利实施的重要保证。手性农药对映体在动物体内的选择性代谢行为研究立项依据 手性农药对映体具有几乎相同的物理化学性质，但
24、生物活性、毒性、毒理及代谢方式等往往差别较大。目前在进行手性农药的毒性毒理评价时，是将含有两种或两种以上对映异构体的外消旋体农药当作一种农药来处理，没有考虑到对映异构体的构型转化或优先代谢的特性，因此使得传统上对手性农药的风险评估是不可靠的，即在进行手性农药的毒性毒理评价时所得的数据是不真实的。 对映体的选择性代谢及转化行为使得以往手性农药的研究数据不能反映其对人类潜在的影响，因此进行手性农药在动物体的选择性代谢具有重要意义。 n研究内容 n 以高效液相色谱手性固定相法建立8种手性农药对映异构体的拆分方法n 手性农药分别包括两种杀虫剂马拉硫磷和水胺硫磷、三种除草剂乳氟禾草灵、吡氟禾草灵和乙氧呋
25、草黄及三种杀菌剂甲霜灵、三唑酮和己唑醇。 n 建立选定手性农药对映体残留于动物组织中的提取、净化及检测方法 n 饲养试验动物， 通过饲喂和静脉注射两种途径进行所选农药的代谢研究，对喂养和注射农药的浓度进行试验筛选。 n 进行同一种动物对不同手性农药及同一种手性农药在不同动物中的选择性代谢行为的系统研究。 n 测定排泄物包括尿液和粪便、血样中对映体的含量及相对比值（ER值）随时间的变化情况，最终检测肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑等组织中农药对映体的含量及ER值并确定对映体间的转化、选择性代谢及残留行为。 n 通过质谱确证代谢产物，探讨代谢机理。 n 通过各个组织中ER值的比较，确定选择性代谢产生的部
26、位，探讨选择性的原因（酶）并进行筛选。 特色与创新之处（1）部分选定手性农药的对映异构体拆分研究目前尚未见报道；n （2）手性农药对映体的代谢研究目前国内外还未见有系统的研究，其用药、样品收集、样品中手性农药的提取、净化和检测分析还未建立完善的方法；n （3）研究手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及选择性的残留行为的新颖性；n （4）动物对手性农药对映体的选择性的代谢、转化等研究是一崭新的领域，缺乏成熟的试验方法，许多假设、理论都需要更多的相关实验研究来验证和发展。不同种手性农药在不同动物体内及不同组织中的选择性的代谢、转化、残留行为的系统研究、差异比较、机理探讨，目前在国内外尚未见报
27、道；n （5）选择性代谢酶的筛选。n （6）依据手性农药对映体的代谢数据，重新认识相关农药的特性，提供更真实的手性农药毒性毒理数据以及有利于人类健康的用药策略。预期研究成果n （1）建立多种手性农药对映体的分离分析方法；n （2）建立手性农药对映体的代谢分析方法；n （3）测定手性农药对映体在所选动物体内的选择性的转化、代谢、残留行为；n （4）探讨手性农药对映体在动物中的选择性代谢机理，筛选出与选择性代谢相关的酶；n （5）为相关手性农药的风险评估及其污染治理提供真实可靠的依据，为其生产提出建设性的意见，减少相关手性农药对人类健康的影响；n （6）在国内外重要学术刊物上发表相关研究论文812
28、篇，完成博士论文2篇，硕士论文1篇。研究意义n （1）开展手性农药选择性转化、代谢、残留的系统研究工作，填补这一领域的许多研究空白；n （2）发展相关农药的手性分离和代谢分析方法；n （3）通过对手性农药在动物体内的选择性的代谢、残留行为研究及机理探讨，对相关手性农药的生产、使用、手性农药法规的制定提出建设性的意见；n （4）通过对选择性代谢酶的研究，提供手性农药的生产方法；n （5）为相关手性农药的风险评估和污染治理提供依据，指导合理用药，减少污染，降低对人类健康的影响。登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位：
29、江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限：邮政编码： 210029 联系电话： 8661714130306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预试验情况。五、计划
30、进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoarthritis，OA）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关
31、节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，OA的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，OA的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而OA引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对OA的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但
32、总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗OA的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗OA也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗OA的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对OA进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，OA是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高
33、，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。Felson等报道70岁以下人群膝OA患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝OA70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。Butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血OA 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性OA患病率2.2%；无症状性OA患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁
34、以下、4049、5059和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节OA易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，OA患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果OA是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋OA均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在Framingham的研究中，Felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 Saase等调查结果，膝OA患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的
35、3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，OA的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前基础研究认为软骨的损伤与退变是OA的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对OA关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液pH值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细胞变性坏死，胶原纤
36、维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学说：认为自由基对软骨细胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与DNA发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA链断裂、碱基损伤从而影响了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放大量O2-和H2O2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死
37、因子（TNF）等在OA中水平明显增高。IL-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时IL-1也是软骨基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：OA软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的IL-1和TNF的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量
38、的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学说：NO是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。NOS可催化重要炎性介质NO的产生，OA患者血清、滑液中NO含量明显高于正常。NO可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋
39、亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有NTPPH（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。OA软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由NO介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由Fas介导。典型的OA不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以NO途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。NO通过两种方式造成组织及细胞损伤
40、。一是高浓度的NO能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是NO与超氧化阴离子2-反应,生成氧化亚硝基阴离子ONOO-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为OH-和NO2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在OA患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。Fas表达的结果与其相符,OA受损区的Fas表达远高于未受损区,提示Fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除NO途径和Fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggrecan G1区等。1.2.3 治疗方面有了不少新
41、方法目前中西医治疗OA的药物较多，西药治疗OA主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，OA多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗OA的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗OA的研究取得了可喜的进
42、步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗OA的中药。未针对OA发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为OA属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为OA的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝OA骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论述了膝OA与血瘀证
43、之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗OA提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗OA，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对OA发病机理的不断深入认识，对OA的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微
44、循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对OA的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是OA的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内SOD及MDA含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在NO对OA影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定NO含量，运用PT-PCR技术测定NOS基因表达。IL-1、IL-6、TNF等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和
45、前列腺素PGE2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。1.3 选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”、“痛痹”范畴。我们认为OA病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般OA病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对OA发病机理的深入研究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对备急千金要方中的独活寄生汤进行
46、化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝OA，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪；威灵仙舒筋通络止痹痛；淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药；当归养血柔肝、舒筋活血；川芎则通达四肢关节，为血中气药；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，
47、明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝OA模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，总之本研究基于现代医学对OA发病机制的最新研究成果，从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗OA的空白，并希望以此为基础，进一步从细胞水
48、平（包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响）研究中药对OA的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。1.4.2目前，中药治疗OA的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗OA的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对OA的确切疗效及作用机理，这必将对OA的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好
