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1、临床病理组织染色技术,苏木素,伊红染色法,南华大学附属第一医院病理科,赵强,一、概述,?,苏木素,伊红染色即通常所说的普通染,色或常规染色，是被广泛经常应用的最基,本的染色方法。取苏木精（,Hematoxyln,）,和伊红（,Eosin,）两个英文单词中的第一,个字母，而简称为,HE,染色。,概,述,?,HE,染色是生物学尤其是医学领域中的组织学、,病理学及细胞学等工作必不可少的最基本染色,方法，在临床病理诊断、教学和科研工作中广,泛应用，具有重要价值。,?,HE,染色主要用来显示各种组织正常成分和病变,的一般形态结构以及病变的发生、发展、修复,的全过程，可进行全面观察。对常规切片染色,中难以
2、判定的病变，再做特殊染色进行验证和,鉴别。,二、染液及溶液的配制,?,1,、,苏木精染液的配制,?,2,、伊红染液的配制,1,、,苏木精染液,?,苏木精染液的配制方法很多。常规,HE,染色用的苏木,精染液多以铝离子作为苏木精的媒染剂。已往用的,哈瑞（,Harris,）氏、埃利希（,Ehrlch,）氏、德拉菲尔,德（,Delafield,）氏及迈耶（,Mayer,）氏苏木精染液,都含钾明矾或铵明矾，故又统称,明矾苏木精,。其实,起媒染作用的，即与苏木精色素形成色淀的只是铝,离子，而不是钾，也不是铵。有的则用硫酸铝作媒,染剂，故宜统称为,铝苏木精染液,。我们在日常工作,中，用的是,克拉兹（,Car
3、azzi,）,氏改良的苏木精染液,。,日本有人将,Carazzi,氏苏木精染液中苏木精及氧化剂,的用量增加为,2,倍或,3,倍，用于,2,3m厚切片的,HE,染色。国内已有报道，效果较好。,克拉兹氏改良的苏木精染液,2,倍量,3,倍量,苏木精,2g 3g,蒸馏水,800ml 800ml,钾明矾,50g 50ml,碘酸钠,0.4g 0.6g,甘,油,200ml 200ml,Mayer,s,苏木素染液,苏木精,100 mg,蒸馏水,100 ml,碘酸钠,20 mg,硫酸铝铵,5 g,柠檬酸,100 mg,水合氯醛,5 g,用蒸馏水溶解苏木精后，依次加入碘酸钠、硫酸铝铵、,柠檬酸和水合氯醛，过滤后存
4、于4冰箱备用。,2,、伊红染液的配制,（,1,）,0.25,0.5%,曙红,Y,水溶液,曙红,Y,0.25,0.5g,蒸馏水,100ml,冰醋酸,1,滴,（,2,）,0.25,0.5%,曙红,Y,乙醇溶液,曙红,Y,0.25,0.5g,80%,乙醇,100ml,伊红染液的配制,曙红主要是染细胞浆和肌纤维、胶原纤维和红,细胞等作为对比染色，染色适中与细胞核相衬，,红兰对比鲜明。,在曙红水溶液中加冰醋酸可起,促染作用，,但加酸太多，可使曙红沉淀而慢慢,失效。,三、,HE,染色的流程,HE,染色流程图（一）,HE,染色流程图（二）,HE,染,色,流,程,图,经过固定的组织取材成小块组织后,10%,甲
5、醛或,AF,液（,10%,甲醛：,95%,酒精：冰醋酸,=8,：,1,：,1,）,75%,酒精（,1.5,小时）,85%,酒精（,1.5,小时）,脱水,*,95%,酒精,2,缸（各,1,小时）,100%,酒精,3,缸（各,1,小时）,二甲苯（,2,缸，各,1,小时）,透明,*,石蜡（,3,缸，各,1,小时）,浸蜡,*,包埋成蜡块备切片用,包埋,*,HE,染,色,流,程,图,?,切片后，烤片（,60,70,1,小时）,贴片、烤片,*,二甲苯,3,缸脱蜡（每缸,5,10,分钟）,脱蜡,*,梯度酒精（,100%,、,95%,各,2,缸和,80%1,缸，各,1,2,分钟）,水化,自来水,/,蒸馏水洗（
6、,5,分钟左右）,染苏木素（,10,30,分钟左右）,染色,水洗（洗净苏木素沉渣，时间自定）,1%,盐酸酒精,1,3,秒钟,分化,*,自来水洗（加点热水冲洗或泡,5,10,分钟）,返蓝,进,95%,酒精或蒸馏水（,2,分钟左右）,伊红（,1,分钟左右）,染色,梯度酒精各,1,分钟,（,80%1,缸、,95%2,缸、,100%2,缸）,脱水,二甲苯（,1,缸，,3,5,分钟）,透明,*,封片、阅片,*,HE,染,色,流,程,图,四、染色结果,细胞核被苏木素染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙,盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。胞浆被伊红染成,深浅程度不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗,粒呈反光强的鲜红色，
7、胶原纤维呈淡粉红色，弹力,纤维呈亮粉红色，红细胞呈橘黄色，核仁呈红色，,蛋白性液体呈粉红色。,五、,HE,制片的质量要求,HE,制片是病理医生用作病理诊断的基本和重要的依据之一。,质量好的,HE,染色切片标本，细胞核与细胞浆蓝红相映，鲜艳,美丽。胞核鲜明，核膜及核染色质颗粒清晰可见。组织和细,胞的一般形态结构特点及很多物质成分均能显示出来。病理,技术员的责任就是为病理医生提供高质量的,HE,制片。,一张高质量的,HE,制片要做到：,（,1,）切片完整、贴片恰当。（,2,）切片较薄和均匀。（,3,）无,皱折。（,4,）无刀痕。（,5,）染色清晰、核浆分明、透明度好。,（,6,）无固缩、龟裂、污染
8、。（,7,）封胶适当、玻片清洁。,（,8,）标签号码清楚，字体端正。,优良的,HE,染色切片标本，可以长期保存。,在整个染色过程中不让切片干涸：,?,切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出,现所谓“龟裂”现象。也会使部分细胞核透明,不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑,核”，影响阅片。,福尔马林沉着及“黑核”,HE,400,烤片温度过高、风干不彻底,x400,刀痕,x40,封片不当，示气泡,网膜结节冰冻切片,x200,免疫组织化学,?,免疫组织化学技术，被广泛应用于病理常规诊,断中近,20,来年。随着从多克隆抗体到单克隆抗,体、从冰冻切片到常规石蜡切片、从免疫荧光,到免疫酶标等一系列技术上
9、的完善，现已经成,为病理诊断的常规技术，发挥了其他常规技术,无法达到的诊断指导作用（对分化差的恶性肿,瘤的鉴别诊断准确率高），因而被病理界称为,“棕色革命”（因为酶标显色以棕黄色颗粒为,主）。,免疫组化染色中的常见问题及对策,?,免疫组化操作方法比较简单，然而在实际工作中也会,遇到一些麻烦，如,脱片、无特异性表达或表达较弱、,染色过强、背景染色强、定位不好,等。引起上述问题,的原因较多，主要有组织固定、脱水不良或浸蜡温度,过高导致抗原丢失；抗原未修复；抗体或工作液失效、,抗体稀释不当；在一定温度下抗原孵育时间不足、一,抗和二抗不匹配；显色剂失效或配置方法失误等。因,此，良好的组织固定和脱水及适
10、当的浸蜡温度是做好,免疫组化的前提。中性福尔马林固定有利于正确结果,的显示。,脱片的可能原因与对策,整批切片脱片,单张切片及整块组织脱片,可能是载玻片未处理，玻片上有油污未清洗或未涂,抹防脱片胶，或烤片时间不足致粘片不牢固。,除了上述原因外，需考虑抗体热修复时液体温度过高,和时间过长，或冲洗时用力过猛等因素。,无特异性表达的原因,问,题,?,确认染色过程次序是否,正确；是否忽略了某一,过程；是否孵育了足够,的时间；是否使用了正,确的抗体，以及二抗是,否和一抗一致匹配。,?,底物显色系统是否失效,。,解,决,方,法,?,重新实验，设立阳性对,照，以验证实验结果；,仔细确定一抗与二抗种,属；,?,
11、更换显色剂（,DAB,或,AEC,）,;,不得使用过期试,剂盒，不同批号试剂盒,不能混用；,表达较弱,问,题,?,标本固定方式不当或固,定时温度过高，使部分,组织抗原被破坏；,?,抗原修复方式不当；,?,抗体浓度过低，或者孵,育的温度、时间不够；,冲洗后切片残留多余缓,冲液。如果阴性对照没,有反应，阳性对照反应,良好，而标本弱阳性，,应考虑查标本本身原因。,解,决,方,法,?,新鲜组织及时固定，防,止自溶，固定时间不超,过,24,小时；,?,封闭时间不超过,10,分钟，,或参考产品说明；注意,复染时间,?,提高抗体浓度，孵育时,间不少于,60,分钟（室温,低于15，改在37 温,箱孵育或4 冰
12、箱过夜）,染色过强,问,题,?,抗体浓度过高或孵育时,间过长,?,孵育温度过高，37,?,显色速度过快或显色时,间过长；,解,决,方,法,?,降低抗体浓度、孵育时,间；,?,室温,1,小时或4过夜；,?,缩短显色时间；显色时,间不超过,5,10,分钟，以,显微镜下观察为准；,非特异性背景染色,问,题,?,操作过程中冲洗不充分；,?,加试剂后切片干燥；,?,组织切片折叠；,?,组织中含过氧化物酶未阻断；,?,组织中含内源性生物素；,?,组织抗原弥散；,?,切片粘附剂过厚；,?,血清蛋白封闭不充分；,解,决,方,法,?,每步冲洗,3,5；,?,防止切片干燥（必要时重做）,?,勿以折叠处观察染色结果
13、；,?,可配置新鲜,3%,双氧水封闭，孵育,时间延长；,?,正常非免疫动物血清再封闭；,?,组织及时固定，固定液要合标准,?,重新配置粘附剂涂液；,?,延长血清封闭时间；,染色定位不好,?,除涉及抗体因素外，应注意标本本身的前期处,理及具体的操作方法等。,PR,PR,ER,Cerb-B2,CD45RO,制作者：南华大学附属第一医院病理科,赵强,组织脱水及目的,?,组织脱水,就是利用某些能与水相混合的化学试剂泡浸,组织，把组织内水分逐步置换出来。,?,目的：,组织经过水溶性固定液固定和水洗后，其间隙,内含有较多水分，因水与二甲苯、石蜡是不能混合的，,即使组织间隙内含有极少的水也会阻碍二甲苯和石蜡
14、,的渗透，所以未经脱水或脱水不彻底的组织不能直接,进入二甲苯透明和石蜡中浸蜡。只有,彻底脱除组织内,部水分，才能进行透明、浸蜡、包埋组织，使蜡块能,长久保存。,#,组织透明及目的,?,组织脱水后，要经过一个浸蜡前的中间溶剂透明过,程，才能进行浸蜡。,?,目的：,组织经脱水后、浸蜡前必须经过某些既能与,脱水剂相混合又能溶解石蜡的中间溶剂处理。组织,在中间溶剂时，组织间隙内存留的脱水剂完全为中,间溶剂所取代时，组织就呈现透明状态，此时即可,进行浸蜡。透明液多采用二甲苯，组织经无水乙醇,脱水后转入二甲苯透明，组织的大小、厚薄不同，,透明时间也不同，一般为,30,60,分钟。,#,组织浸蜡及注意点,?
15、,用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低（,56,58），,低温浸蜡对保存组织细胞内的抗原免疫活性，,避免组织收缩和变硬变脆有帮助。根据脱水机,配有的蜡缸数量，浸蜡采用二级至四级，以尽,量清除二甲苯。不同大小和厚薄的组织浸蜡时,间有所不同，一般为,1,3,小时。浸蜡温度过高，,浸蜡时间过长均可导致组织收缩，变硬变脆，,难以切出理想切片。,#,组织包埋,?,组织经浸蜡后即可进行包埋。包埋时，包埋石蜡的温,度要比组织高（约35），否则包埋冷凝后组织与,包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，,否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋,时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮,肤、肠管和囊
16、壁等层次清楚的组织其切面应包含有各,层组织。组织包埋完后，蜡块要与取材时记录的组织,形状和数量核对，发现问题，及时解决。,#,组织切片,?,组织切片厚薄要适宜，薄的切片细胞不会重叠，,易于观察。切片的厚度应为,3,4，对一些组,织如淋巴结、鼻咽和扁桃体，切片的厚度应为,2,3。要切出薄而平整的切片需要正确使用,切片机，切片前要把切片机上有关的各螺旋拧,紧，如没有拧紧切片机上有关的各螺旋，保证,切片刀锋利和调至合适的角度。组织蜡块过硬，,切片刀或蜡块没固定好，会出现跳刀、切片成,一截厚一截薄的现象。,贴片烤片,?,切出的蜡片（可先放在约,1015,乙醇内，然后）,置恒温水中，这样因水的表面张力比
17、乙醇大，蜡片,便容易在温水中展平，根据包埋石蜡的熔点不同，,水温约为,39,42左右。贴片时要注意贴在载玻,片中间稍偏右的位置上。对一些组织如皮肤、胃肠,等贴片时要注意表皮或粘膜面在下，真皮或肌层在,上，方便在镜下观察。贴好片后放入约,60,65,的烤箱内或恒温热板上烤烘,1530,分钟，使蜡片牢,固地粘附在玻片上。烤烘切片的温度一般比包埋石,蜡的熔点高5左右。,#,切片脱蜡,?,切片在染色前必须脱蜡干净，脱蜡不干净会影,响组织细胞的着染，即使着染，组织和细胞也,会模糊不清。脱蜡一般用两级或三级脱蜡剂如,二甲苯，时间为,10,20,分钟。如果脱蜡剂使用,多次或室温较低，均需延长脱蜡时间。,#,
18、分化,?,分化,是把过染的细胞核部分和不应着染苏木精的细胞,浆等组织成分脱色，从而使着染的细胞核与细胞浆及,细胞周围的组织成分对比清晰。分化时间的长短视组,织的性质，切片的厚薄，苏木精染色的深浅和,分化液,（配制）,的新旧来决定，一般是,2,5,秒钟，若切片不,分化或分化不足，组织不仅着染细胞核，也着染细胞,浆等其他成分，使组织结构对比不清晰；若分化过度，,细胞核过淡或褪色。用,Mayer,s,苏木精染色，通常都不,用分化。盐酸乙醇分化后，一般需流水冲冼，避免切,片留有盐酸，使细胞核褪色。另一方面苏木精经酸后,要经流水冲洗来促兰。流水冲冼一般需,15,30,分钟。,如要缩短时间，可用碱性的促兰
19、液来代替流水冲洗。,分化液的配制,0.1%,盐酸,-,乙醇分化液的配制,浓盐酸,1 ml,70%,乙醇,99ml,#,切片脱水透明,切片经,HE,染色后，要彻底脱水透明，才,能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，,封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，,且容易褪色。切片经,1,2,级无水乙醇脱,水，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。,石碳酸有较强脱水能力，但长时间可使,切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使,石碳酸完全除去。,#,封片,切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可,使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而,变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓，,封片时容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外,溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺,胶的现象。,*,封片时的注意事项,1,、封片时动作快,2,、切片入二甲苯后起白雾，为脱水未尽,3,、记住切片的组织面,4,、防脱片处理,5,、盖片必须大于组织块,6,、封固剂不要滴得太多，也不要太少，防止气,泡产生。,#,
