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1、HIV抗体检测技术,湖北省疾病预防控制中心性艾中心,陈慧萍,2011年9月,HIV抗体检测,行业标准:艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准WS298-2008技术规范:全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,艾滋病诊断的特殊性,高度依赖实验室诊断HIV检测的严肃性：保证输血、器官移植的安全 错误结果将导致严重的法律问题结果严格保密,艾滋病病毒的形态,HIV的逆转录酶缺乏35核酸外切酶活性，无法修复逆转录和复制过程中发生的错误。,HIV颗粒,艾滋病病毒的结构,HIV生活周期,吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放,HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合,P55,gp160,P
2、17,P24,P7,P6,P10,P66/51,P15,P32,gp120,gp41,HIV感染后的血清学改变,诊断：确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。监测：了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。血液筛查：防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。,HIV抗体检测目的,筛查试验初筛复检确证试验,HIV抗体检测程序,筛查试验,筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂
3、。HIV抗体筛查样品血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液。,2010年筛查试剂评估,2010年筛查试剂评估,2010年筛查试剂评估,筛查方法酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验（CLIA）：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。快速检测（RT）及其它检测试验(1)明胶颗粒凝集试验(PA)(2)斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验(3)免疫层析试验,HIV抗体筛查试验,初筛试验对呈阴性反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。复检试验对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外
4、两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。,HIV抗体筛查检测流程图,(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）,可使用血液、唾液、尿液样品单纯HIV抗体检测试剂HIV抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。,四代艾滋病酶联免疫试剂比较,第四代,病毒裂解液重组抗原合成肽HI
5、V-1/-2/-Oanti-p24 Ab,IgM/IgG 抗体HIV-1/-2/-Op24 抗原,病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24 抗体,method,间接,间接,夹心,夹心,ELISA双抗原夹心法原理,ELISA法结果判断,临界值概念:将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值判断标准:标本OD值与临界值的比值大于等于1(S/CO1)为阳性（对间接法及双抗原夹心法）注意:不同厂家、不同方法临界值计算公式不同cutoff=NC+0.1(0.15,0.12)cutoff=NC*2.1,酶联免疫吸附试验（ELISA）,优点：准确
6、性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存用途：流行病学监测及临床大量标本的检测,(2)化学发光或免疫荧光试验,采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。,（3）快速检测（RT）及其它检测试验,优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在1030分钟内得出结果。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。,（1）明胶颗粒凝集试验（PA）将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，
7、与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。,快速诊断试剂,PA法原理,PA法操作步骤,PA法,PA法,（2）斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上,加血清样品。斑点EIA法用酶标记抗体，以后步骤同ELISA。斑点免疫胶体金（或胶体硒）用红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白标记，用渗滤法作为洗涤方法。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。,快速诊断试剂,金标诊断试验原理,快速诊断试验,（3）免疫层析试验(金
8、标法、硒标法)以硝酸纤维膜为载体。加样区：预包被胶体金-抗原/胶体金-protein A结合物测试区（T）：固定有重组HIV抗原，质控区：抗HIV单克隆抗体/抗-protein A抗体,快速诊断试剂,全血样品 加50ul样品于样品垫中,手指血方法,静脉血方法,加一滴缓冲液,15分钟内读取结果,硒标法操作步骤,病人条,质控条,快速诊断试验,优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在1030分钟内得出结果。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。注意：一定要将试剂平衡至室温,快速诊断试剂,HIV抗体确认试验,确认试验的试剂：必须是经国家食品药品监督管理
9、局注册批准、在有效期内的试剂。确认试验方法：免疫印迹试验(WB)条带免疫试验(LIATEK HIV)放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)国内常用的确认试验方法是WB。,HIV抗体确认实验结果,筛查试验阳性反应样品,HIV抗体确证检测流程图,HIV抗体确认试验不确定结果,P24：非特异性反应（孕妇，正常人）Gp160：非特异性反应，感染早期，感染晚期Gp160，gp120：非特异性反应，感染早期，感染晚期Gp160，p24：非特异性反应，感染早期，感染晚期Gp160，gp120，p24：感染早期，感染晚期 污染？,HIV抗体检测的要点1、根据目的选择检测方法及检测策略。2、严格遵
10、守实验室SOP。3、筛查试验阳性，须作确证实验。4、筛查试验阴性，不应做确证实验。5、筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。,HIV 抗体检测不能用来诊断：HIV 急性感染新生儿HIV 感染,艾滋病病毒感染产妇所生儿童,阳性,阴性,用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测,12个月进行HIV抗体筛查试验,确证试验,18个月时再进行HIV抗体筛查试验,报告HIV抗体检测结果阴性,艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程,阳性,阴性,阴性,阳性,用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测,阴性,阴性,阳性,报告HIV抗体检测结果阳性,提供咨询，继续随访，4周后再次进行确证试验,不确定,阳性,婴幼儿HIV感染的抗体检测,适用范围：HIV感染产妇所生婴幼儿；已满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。婴儿应于12个月进行HIV抗体检测，结果阴性则排除感染，纳入正常儿童保健；阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行HIV抗体检测，结果阴性排除感染。,谢谢！,
