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1、第二章 黄酒酿造微生物,微生物与发酵,发酵工程是以微生物的生命活动为中心的微生物的生物学性状和发酵条件决定了其相应产物的生成,微生物对酒质起决定作用,影响酿酒微生物的因素：环境：南方、北方、流域糖化发酵剂：大曲（高温曲、中温曲）、小曲、麸曲、强化曲窖内发酵=配料比例：加曲、辅料、配醅、加水、入窖温度、顶火温度等发酵容器：石窖、泥窖、地缸等,黄酒酿造中主要微生物,黄酒酿造中的微生物主要为霉菌和酵母。来源：麦曲(或米曲）酒药 酒母（酵母）,霉菌，意指“发霉的真菌”，是一群丝状真菌的通称。霉菌先由一个孢子萌发出芽长出芽管，继而长成管状的菌丝，菌丝是霉菌营养体的基本单位，其直径一般为210m，与酵母菌
2、的宽度相似。接着菌丝体开始形成初级菌丝，继续分支成为次级菌丝，最后生长发育成菌丝体或菌丛。霉菌菌丝细胞与酵母菌细胞十分相似，均由细胞壁、细胞膜、细胞质及其内含物、细胞核等组成。,colony,霉菌的菌落形态较大，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状，绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。,麦曲,麦曲是指在破碎的小麦粒上培养繁殖糖化菌而制成黄酒生产糖化剂。它为黄酒酿造提供各种酶类，主要是淀粉酶和蛋白酶，促使原料所含的淀粉、蛋白质等高分子物质的水解；同时在制曲过程中形成的各种代谢物，以及由这些代谢产物相互作用产生的色泽、香味等，赋予黄酒酒体
3、独特的风格。麦曲中主要含有黄曲霉（或米曲霉）、根霉、毛霉和少量的黑曲霉、灰绿曲霉、青霉、酵母等。麦曲分为块曲和散曲，块曲主要是踏曲、褂曲、草包曲等，一般经自然培养而成；散曲主要有纯种麦曲、爆麦曲、熟麦曲等，常采用纯种培养制成。,生麦曲表皮金黄，断面白色或白褐色，菌丝较稠密，但分生孢子较少。熟麦曲由于纯种培养，培养温度在它的适合温度下，熟麦曲的菌丝粗壮，分生孢子较多，使曲的颜色稍带黄绿色。,uncooked wheat starter cooked wheat starter,曲霉菌曲霉为多细胞，菌丝有分隔。营养菌丝大多匍匐生长，无假根。分生孢子梗从厚壁而膨大的菌丝细胞生出，并略垂直。分生孢子梗
4、常顶端膨大而形成棍棒形，椭圆形，半球形、球形的顶囊。顶囊表面产生小梗，单层或双层。曲霉菌主要存在麦曲、米曲中，在黄酒酿造中起糖化作用，以黄曲霉为主，还有较少的黑曲霉。,黑曲霉分生孢子穗扫描电镜图片,黄曲霉菌具有活力强大的酸性蛋白酶和淀粉酶，能产生丰富的液化型淀粉酶和蛋白质分解酶。液化型的淀粉酶能分解淀粉产生糊精、麦芽糖和葡萄糖，该酶不耐酸。蛋白质分解酶对原料中的蛋白质进行水解形成多肽，低肽及氨基酸等含氮化合物，能赋予黄酒以特有的风味。我国很早就利用黄曲霉生产各种传统大豆发酵食品，如酱油、豆酱、面酱等。,黑曲霉菌主要产生糖化型淀粉酶，耐酸，该酶有规律的水解淀粉生成葡萄糖，糖化持续性强，酿酒时淀粉
5、利用率高。同时还会产生葡萄糖苷转移酶，通过转苷作用可将葡萄糖转化生成不发酵性的异麦芽糖和潘糖，降低出酒率而能增加酒的醇厚性。但黑曲霉的孢子常会使黄酒加重苦味。,踏曲的工艺流程,过筛,水,小麦,拌曲,扎碎,成型,堆曲,保温培养,通风干燥,成品,成品麦曲应该具有正常的曲香味，白色菌丝均匀密布，无霉味和生腥味，在30时，每克曲每小时能产生7001000mg葡萄糖。,纯种麦曲采用纯粹的黄曲霉（或米曲霉）菌种在人工控制的条件下进行扩大培养制成麦曲称为纯种麦曲，它比自然培养的麦曲的酶活性高，用曲量少，适于机械化新工艺黄酒的生产。,原菌,麦曲通风培养,种曲扩大培养,三角瓶扩大培养,试管培养,制造麦曲的菌种应
6、具备以下特征：1、淀粉酶活力强而蛋白酶活力较弱2、培养条件粗放，抵抗杂菌能力强，在小麦上能迅速生长，孢子密集健壮3、能产生特有的曲香4、不产黄曲霉毒素,酒药,酒药又称小曲，酒饼，白药，主要用于生产淋饭酒母或以淋饭法酿造甜黄酒。利用酒药保藏优良微生物菌种是我国古代劳动人民的独创方法。酒药作为黄酒生产的糖化发酵剂，它含有的主要微生物是根霉、毛霉、酵母和少量的细菌及犁头霉等。酒药具有制作简单，贮存使用方便，糖化发酵力强而使用量少的优点。,根霉根霉是黄酒小曲（酒药）中含有的主要糖化菌，糖化能力强，几乎能使淀粉全部水解成葡萄糖，还能分泌乳酸、琥珀酸和延胡索酸等有机酸，降低培养基中的pH，抑制产酸细菌的污
7、染。根霉因有假根而得名，属于单细胞生物，菌丝无分隔。具有由营养菌丝产生匍匐菌丝，靠近培养基表面横向生长，并连接假根，当生长到一定阶段，会向上生出孢囊梗，顶端形成孢子囊，内生孢囊孢子。,酒药的制作工艺流程,陈酒药,晒干除茎去杂,除去谷壳、磨粉,水,新鲜辣蓼草,新早籼谷,拌料,接种,辣蓼草粉末,打实、切块、滚角,入缸保温,出窝,入匾,换匾,装萝,并匾,晒药,并萝,成品,成品酒药应为白色，口咬质地疏松，无不良气味，糖化发酵力强。陈酒药作为种母，接入米粉量为13。酒药一般在初秋前后，气温30左右，有利于发酵微生物的生长繁殖。酒药中添加各种中药可制成药曲。,纯种根霉曲的制作工艺流程,根霉菌种,试管液体酵
8、母,拌料蒸煮,水,酵母菌种,麸皮,装箱静止培养,三角瓶酵母液,扬冷接种,间接通风培养,连续通风培养,混合配比、烘干,根霉酵母混合曲,麸皮固体酵母,三角瓶种子,帘子种曲,纯种根霉曲是采用人工培育纯粹根霉菌和酵母制成的小曲，用它生产黄酒能节约粮食，减少杂菌污染，发酵产酸低，成品酒的质量均匀，口味清爽，还可提高510的出酒率。传统的酒药是根霉、酵母和其他微生物的混合体，能边糖化边发酵，以满足浓醪发酵的需求，所以，在培养纯种根霉曲的同时，还要培养酵母，然后混合使用。加入根霉曲中的酵母曲量应为6最适宜。,红糟是红曲霉和酵母菌的扩大培养产物，是制备乌衣红曲的种子之一。,浙江、福建部分地区以籼米为原料生产黄
9、酒，采用乌衣红曲作糖化发酵剂。乌衣红曲是米曲的一种，它主要含有红曲霉、黑曲霉、酵母菌等微生物。乌衣红曲具有糖化发酵力强耐温耐酸等特点，酿制出的黄酒色泽鲜红、酒味醇厚、但酒的苦涩味较重。,红曲,左：烏衣紅麴 右：紅麴(宋氏)丹麴=土麴(麴公)=烏衣紅麴,红曲霉红曲霉菌能分泌红色素而使曲呈现紫红色，是生产红曲的主要微生物。红曲霉能产生淀粉酶、蛋白酶等，并能产生柠檬酸、琥珀酸、乙醇等有机物。红曲霉具有耐酸性，在pH3.5时，能压倒一切霉菌而旺盛的生长，使不耐酸的霉菌抑制或死亡。,酵母黄酒中使用的酵母不但有很强的酒精发酵力，而且要能产生传统黄酒的风味。在选育优良黄酒酵母菌时，除了鉴定其常规特性外，还必
10、须考察它产生尿素的能力，因为在发酵时产生尿素，将与乙醇作用生成致癌的氨基甲酸乙酯。,黄酒酵母必须符合以下要求：1、发酵迅速并有持续性；2、具有较强的繁殖能力，繁殖速度快；3、抗酒精能力强，耐酸、耐温、耐高浓度和渗透压，并有一定的抗杂菌能力；4、发酵过程形成尿素能力弱，使成品黄酒中的氨基甲酸乙酯尽量减少；5、发酵后的黄酒应有传统的特殊风味。,淋饭酒母又叫酒娘，在传统的摊饭酒生产以前约2030d，要先制作淋饭酒母，以便酿制摊饭酒时使用。在生产淋饭酒母，（或淋饭酒）时，用冷水淋浇蒸熟的米饭，然后进行搭窝和糖化发酵，把质量上乘的淋饭酒醅挑选出来作为酒母，其余的经压榨煎酒成为商品淋饭酒。酒母要求酒醅发酵
11、正常，酒精含量在16左右，酸度在0.310.37g/100mL左右，口味老嫩适中，爽口无异杂味。,纯种酒母的制作就是指利用纯种酵母进行扩大培养的方法所制成的酒母，即可以通过选择、筛选、驯育出优良的黄酒酵母，然后，从试管菌种开始，经过扩大培养，增殖到一定量时所采用的酵母醪液。纯种酒母，目前普遍采用速酿酒母和高温糖化酒母两类。速酿酒母：它和传统的黄酒发酵同时具有边糖化边发酵的特点，酿制周期短。,高温糖化酒母高温糖化就是在比较高的温度下进行糖化，特点是醪液糊化后，冷却至60时进行加曲或加酶糖化，再经升温灭菌后降温接种，其优点是采用稀醪糖化，对微生物细胞的渗透压低，有利于酵母在短期内迅速繁殖生长，又因
12、杂菌少，酸度低，酵母细胞健壮，发酵旺盛，出酒率高，是新工艺黄酒生产的较好选择。,2、黄酒酵母研究,葡萄糖,乙醇,CO2,酒精发酵风味代谢,黄酒酵母与黄酒生产效率与品质的关系,经验,科学,风味物质,酒精发酵效率风味代谢品质,黄酒酵母质量评价体系研究；黄酒酵母风味特征研究；黄酒酵母定向改良研究。,酿酒用酵母性能一般评价指标,选择酵母菌种就如同选择生产工具，产工具合适了劳动效率才会提高！,黄酒酵母质量评价体系,综合研究工业生产用黄酒酵母的酿造性能,2023/3/25,黄酒酵母质量评价,不同黄酒酵母具有不同的酿造性能特点；根据工艺特点选择合适的酵母菌种；根据菌种特性指导工艺操作调整，及菌种改良。,酿酒
13、酵母对风味的影响,怎样酿出风格多样的黄酒？,目前商业化的葡萄酒酵母菌种超过200种，每一种葡萄，每一种风格的葡萄酒都有与之对应的专用葡萄酒酵母。,日本酿造协会颁布的酿造用清酒酵母,大多数清酒酵母均是采用风味定向，人工改造的思路获得。,从酿造的角度实现风味多样化是发酵酒生产的主流！,不同原酒感官品评香气存在较大差异,酵母代谢相关香气物质,黄酒酵母风味特征研究,浙江地区:苯乙醇，3-甲硫基丙醇，酯类；上海地区:高级醇江苏地区:有机酸,酵母风味特征的地域差别明显,黄酒酵母风味代谢调控研究,黄酒风格-传统型,黄酒风格-清爽型,黄酒风格-其他,消费者口味1,消费者口味2,消费者口味3,黄酒酵母的选用风格
14、多元化,由黄酒风味特点为依据，研究各种黄酒酵母对产品的影响，从菌种角度改进黄酒风味。,定向、快捷，但安全风险大，多限于实验室研究。,人为加快物种进化速度，定向、高效，无安全风险。,获取优良生产菌种是酿造家永恒的追求！,黄酒酵母的改良研究,建立了中国黄酒酵母质量评价体系 为优良黄酒酵母的选育提供了方法学指导。,针对黄酒酵母发酵性能、风味特点等特性,繁琐，效率低下。,采用适应进化策略选育环境胁迫耐受能力明显提高黄酒酵母新菌株,黄酒酵母的改良-适应进化技术,适应进化后黄酒酵母新菌株与出发菌株乙醇耐受性比较,适应进化后黄酒酵母新菌株与出发菌株热冲击耐受性比较,适应进化后黄酒酵母新菌株与出发菌株高渗耐受
15、性比较,S1,S1,S1X-8,S1X-16,S1X-16,S1X-8,S1,S1X-8,酿造过程中酵母死亡率明显降低；适应进化突变菌株发酵更彻底,药物抗性导向高发酵性能黄酒酵母选育,or UV,2、三角瓶发酵，测失重比较发酵力及最大发酵速率,1、试管发酵，测残糖,3、重复三角瓶发酵验证,筛 子,抗性稳定菌株,三级筛选,G-2,传统诱变,药物抗性筛选,发酵性能复筛,发酵性能提升突变菌株,药物抗性优良菌株筛选策略,低产尿素酵母选育,实验室水平黄酒酿造小试,23.43%,原始菌 药物耐性菌,or UV,传统诱变,药物抗性筛选,酵母精氨酸酶活（以精氨酸为诱导物）,注：不同字母代表差异显著（P0.05
16、）,酵母尿素生成途径,原因初探,发酵性能比较,工厂放大试验,大罐发酵过程中发酵优势得以体现,Isolated from sake breweryHigh fermentation abilityFermentation at a low temp.Good flavor of productFoam formation on the mash,Sake yeast,Other yeastLab.yeast,(Saccharomyces cerevisiae),Characteristics of sake yeast,Sake yeast Kyokai no.7,Our goals Chara
17、cterization of sake yeast at a gene level Breeding of good sake yeast strains,Gianni et al.Nature,2009,Sake yeast,wine yeast,Phylogeny of yeast by genome analysis,Lab.yeast,Genome comparison of sake and lab.yeasts,Genome difference between of sake and lab.yeasts,Sake yeast K7,Lab.yeast S288C,Chimp,H
18、uman(我们的董事长),1.2,3.8,其他微生物,醋酸菌乳酸菌枯草杆菌,研究微生物的方法,传统方法：分离培养,分离,纯化,纯种培养,生理生化鉴定,传统培养方法优势,对于分离得到的微生物，可以分析其在生长发酵过程中，生理生化反应、代谢产物、酶类等数据，据此可以推断微生物在发酵过程中的可能作用。经过分析确定的某些微生物可以直接扩大培养，用于酒曲的微生物强化。,传统培养方法劣势,不能直接快速确定分离微生物的种类，需要进一步实验；不能确定样品中微生物体系的组成；无法分离在现有方法下不能生长的微生物；不能培养公认的不能培养的微生物；无法分离生长缓慢的微生物。,传统方法的新手段,Biolog法是由美国
19、Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质（如TTC、TV），固定于96孔板上（A1孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。,鉴定初始首先按常规微生物操作方法分离出纯种。鉴定步骤如下：第一步、用Biolog专用培养基将纯种扩大培养。第二步、按要求配制一定浊度(细胞浓度)的菌悬液。第三步、将菌悬液接种至微孔鉴定板(Mi
20、croplate)，培养一定时间。第四步、将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，软件自动给出鉴定结果。,Biolog的特点1、快速读取结果：鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件将该吸光值与数据库对比，就可在瞬时给出鉴定结果。试验结果可由计算机系统进行自动分析、记录和打印。2、强大的数据库：Biolog微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内总计1973种微生物，几乎涵盖了所有的人类、动物、植物病原菌以及食品和环境微生物。3、智能化处理分析软件4、操作简单,Biolog法的缺点：不能鉴定不能培养或者生长非常缓慢的菌种；不能定量分析样品中微生物比例关系；时常难以确定最后
21、结果。,微生物分子生态学,将分子生物学技术与微生物学、生态学相结合的微生物分子生态学方法可以不经传统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其与环境的关系。,当前酿酒微生物研究的发展趋势,与传统的培养方法相比，分子生物学技术直接揭示发酵过程中各种微生物的消长规律，探讨发酵过程中微生物的种群结构，并且可以更真实、客观地反映自然环境微生物群落的组成、结构和功能，显示出明显的优越性。,（一）PCR-DGGE法PCR扩增产物由变性梯度凝胶电泳（DGGE）分离、纯化、测序、比对,DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，是根
22、据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用分子标记方法。现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。,酒曲中总宏基因组DNA的提取,PCR扩增16S rDNA片段,250bp,不
23、同时期酒曲样品的DGGE图谱,PCR-DGGE在酒曲微生物研究中的应用,通过条带序列比对分析找到其标准相似菌株，建立亲缘关系树,从理论上讲，DGGE/TGGE指纹图上的一个条带就代表一个微生物类群(分类水平可达种)。因而，指纹图谱直观反映了微生物群落的结构和多样性，还方便判断出优势菌或功能菌。回收某一条带的DNA片断，经PCR再扩增后测定其序列，通过与基因序列数据库中的已知序列比较，可以确定其种系发育位置。经过序列检定的基因序列，还可设计成探针，以荧光原位杂交技术监测微生物群落中特定类型的微生物的变化。,PCR-DGGE的优点是能够形成图像文件：通过带型分析，初步确定微生物菌群的特征与变化。,
24、PCR-DGGE的缺点第一，分离的PCR产物种类较少（一般10种左右），难以对微生物菌群做全面分析，且通过条带强弱判断微生物的多少，不能定量，扩增片段为0.2-0.3kb，信息量少，因此这些序列只能提供有限的系统发育信息；第二，如果选用的实验条件不恰当，不能保证可以将有一定序列差异的DNA片段完全分开，从而会出现序列不同的DNA迁移到胶的同一位置；第三，有些细菌具有多操纵子，DGGE能将其在PCR时形成的不同序列分离开，这样就可导致过高的估计环境中的微生物多样性；第四，DGGE只能检测到一定数量的微生物的存在，通常只能检测到环境中的优势菌群的存在。,（二）、rDNA基因文库法,酒曲中总宏基因组
25、DNA的提取,PCR方法扩增16S和18S rDNA基因片段,克隆PCR扩增片段，分别构建16S和18S rDNA基因文库,克隆基因的测序,序列比对分析，确定微生物种类及丰度、亲缘关系远近等,rDNA基因文库法的优势,1、直接确定样品中的微生物种类及组成；2、能够全面分析样品中存在的所有微生物种类；现有条件下能够培养的微生物现有条件下不能培养的微生物公认的不能培养的微生物生长缓慢的微生物发现新的微生物种类3、定量分析各种微生物在样品中的比例；4、能够实现对样品各时期微生物种类组成情况做出全面的反映。,rDNA基因文库法的应用,1、对于定向分离培养样品中微生物具有指导作用使用不同培养基和培养条件
26、，分离“实际”可以被培养的微生物。根据微生物种类信息，通过数据库检索，快速掌握相关微生物已有的信息，包括生理生化及代谢等相关知识。,2、应用于快速准确分析同种样品不同时期微生物组成情况和不同地域样品的比较通过在建立酒曲制曲不同时间和发酵不同时段的微生物rDNA文库的基础上，采用生态学方法分析各时期的种群结构，确定各时期的群落和优势种，从而深入的了解白酒在制曲和发酵全过程微生物群落的演替规律，将会对每个时期的群落特点和功能作用以及微生物的相互作用有更为深入和全面的认识。于此同时通过对某种微生物生态位的动态分析，将会很清楚的了解该种微生物在白酒生产过程的更为具体的功能作用，为更好更快的利用其提高白酒品质提供理论基础。,3、辅助分析特殊香气成分来源的应用,已知香气成分,已知微生物,未知来源香气成分,微生物,？,rDNA分析快速确定菌种并与其他方法相结合,反推,
