第23章三羧酸循环课件.ppt

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1、Chapter 23.柠檬酸循环,绪论:,在无氧条件下，葡萄糖经分解代谢形成丙酮酸，丙酮酸继续形成乳酸或乙醇。在有氧条件下，丙酮酸可继续进行有氧分解，最后完全氧化，形成CO2和水。此途径分为柠檬酸循环和氧化磷酸化两个阶段。定义：在有氧条件下，葡萄糖酵解产生的丙酮酸氧化脱羧形成 乙酰CoA。乙酰CoA经一系列氧化、脱羧，最终生成CO2 和H2O并产生能量的过程，称为柠檬酸循环，由于柠檬 酸含三个羧基，所以亦称为三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA 循环)。由于它是由H.A.Krebs(德国)正 式提出的，故又称Krebs循环。,TCA循环是糖、脂肪、蛋白质和氨基酸

2、等氧化所共同经历的途径。同时，TCA循环生成的中间物也是许多生物合成的前体。因此TCA循环是两用代谢途径。,一.柠檬酸循环的发现历史,从1932年至1936年，Krebs H A 和其它几位科学家 共同研究，最后由Krebs 提出完整的柠檬酸循环途径。于 1953年获得诺贝尔奖。(1).Krebs H A发现:肌肉、肾脏、肝脏等组织的匀浆悬浮液或切片的材料中，发现柠檬 酸、琥珀酸、延胡索酸及乙酸等化合物在各不同组织中的氧化速率 均最快。向肌肉悬浮液中加入草酰乙酸，能迅速生成柠檬酸,又发现柠檬酸 是草酰乙酰和一种来自丙酮酸或乙酸的化合物合成的。(2).Albert Szent-Gyorgyi发现

3、:肌肉组织悬浮液中加入少量草酰乙酸或苹果酸等4C二羧酸，则氧 利用量远超过加入的二羧酸氧化为CO2和水所需要的氧分子。(3).Carl Martius和Franz Knoop发现:柠檬酸通过顺-乌头酸被异化为异柠檬酸，然后再氧化脱羧形成-酮 戊二酸，-酮戊二酸经氧化形成琥珀酸。,綫粒体:降解脂肪酸,氧化丙酮酸以提供能量MITOCHONDRION:reduce fatty acid and oxidize Pyruvate to produce ATP.,三羧酸循环在线粒体基质中进行。,二、由丙酮酸形成乙酰CoA,丙酮酸进入线粒体转变为乙酰CoA,这是连接糖酵解和三羧酸循环的纽带：,反应不可逆，

4、分4步进行，由丙酮酸脱氢酶复 合体(丙酮酸脱氢酶系)催化。,1.丙酮酸脱氢酶复合体,(1).丙酮酸脱氢酶复合体是一个十分复杂的多酶复 合体，包括丙酮酸脱氢酶组分E1、二氢硫辛 酰转乙酰基酶E2、二氢硫辛酸脱氢酶E3。(2).参加反应的还有焦磷酸硫胺素(TPP)、硫辛酰胺，FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸),NAD+,CoA-SH及Mg2+六种辅助因子组装而成。,1.1 大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体的内容,2.催化丙酮酸转变为乙酰CoA的反应步骤,2.1丙酮酸脫羧反应（丙酮酸变成乙酰基）,这是第一步反应,由丙酮酸脱氢酶E1(以TPP為辅基)催化,可划分为两个步骤。,(1)羟乙基-TPP的形成,解离的负碳

5、离子向丙酮酸的羰基进攻,使形成丙酮酸与TPP的加成化合物。,A、丙酮酸-TPP加成化合物的形成,B、丙酮酸TPP加成物脱羧反应形成羟乙基-TPP,丙酮酸-TPP加成物脱羧,形成羟乙基-TPP，由于TPP环上带正电荷的氮原子起电子“陷井”作用,使脱羧后形成的羟乙基上产生较稳定的负碳离子。,（2).羟乙基氧化形成乙酰基,羟乙基氧化转变为乙酰基并转移至二氢硫辛酰转乙酰基酶E2的辅基硫辛酰胺上，这是为下一步反应作准备。丙酮酸脱氢酶组分(TPP-E1)完成了乙酰基的转移后即恢复原状，又可接受另一丙酮酸分子。,第二步反应,在二氢硫辛酰转乙酰基酶分子E2上结合着的乙酰基,由E2催化,将乙酰基转移到CoA-S

6、H分子上,形成游离的乙酰-CoA分子,从而使二氢硫辛酰转乙酰基酶E2由氧化型变成还原型。,2.2 乙酰基转移到CoA分子上形成乙酰CoA（由E2完成）,2.2.1 反应机制,该反应实际上是一个酰基转移反应，辅酶A的硫氢基进攻E2-乙酰二氢硫辛酰胺上的乙酰基,先形成一个四面体的中间体,接着迅速分解为乙酰-CoA和E2-二氢硫辛酰胺,在此形成的游离状态的乙酰-CoA分子保留了高能的硫酯键(一个高能硫酯键)。,2.3 还原型二氢硫辛酰转乙酰基酶E2氧化,由还原型变成氧化型（由E3完成）,这一步反应是使氧化型硫辛酰胺再生的反应。,2.3.1反应机制,这一步反应使氧化型硫辛酰胺再生,在此反应中，催化此反

7、应的酶为二氢硫辛酸脱氢酶E3（其辅基为FAD），使二氢硫辛酰胺再氧化,从而使其完成整个反应过程，重新形成氧化型二氢硫辛酰转乙酰基酶。,2.4、还原型的E3再氧化,还原型E3二硫键的再氧化先由该酶的辅基FAD接受一SH基的氢原子,形成FADH2,其后将氢原子转移给NAD+,于是恢复其氧化型。,总反应式可表示为:,丙酮酸+CoASH+NAD+乙酰CoA+CO2+NADH+H+,3.丙酮酸脱氢酶复合体的调控,由于丙酮酸既可走向提供能量的分解途径,又可走向生物合成 途径，故受到严密的调节控制：1、产物抑制：受乙酰CoA和NADH的控制。乙酰CoA抑制转 乙酰基酶E2组分，NADH抑制二氢硫辛酰脱氢酶E

8、3组分。抑 制效应被CoA和NAD+逆转。2、磷酸化和去磷酸化作用的调节：丙酮酸脱氢酶组分E1的 磷酸化状态无活性，反之有活性,其磷酸化受E2上结合的激 酶和磷酸酶作用。,三、柠檬酸循环概貌,四、柠檬酸循环的反应机制,1.第1步反应:草酰乙酸与乙酰-CoA缩合形成柠檬酸,1.2 反应机制,1.4 柠檬酸合酶,柠檬酸合酶是柠檬酸循环的关键酶。1）其活性受ATP、NADH、琥珀酰-CoA、脂酰-CoA等的抑制。2)类似物抑制及其应用：（1）丙酮酰-CoA是乙酰-CoA的类似物,可能代替乙酰-CoA与柠檬酸合酶结合。（2）由氟乙酸形成的氟乙酰-CoA可被柠檬酸合酶催化与草酰乙酸缩合生成氟柠檬酸，氟柠

9、檬酸结合到顺-乌头酸酶的活性部位上，抑制 柠檬酸循环向下进行。氟乙酸和氟乙酰-CoA可做杀虫剂或灭鼠药，各种有毒植物的叶子大部 分含有氟乙酸，可作为天然杀虫剂。,2、柠檬酸异构化成异柠檬酸,2.1 反应方程式,在pH7.0，25C的平衡态时，柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：4：6,由于异柠檬酸在下一步反应中极迅速地被氧化,从而推动此反应向异柠檬酸的方向进行。,3、由异柠檬酸氧化脱羧生成-酮戊二酸,3.1 反应方程式,3.2 反应机制,异柠檬酸为-羟酸，辅助因子NAD+作为受氢体形成-酮酸即草酰琥珀酸位于异柠檬酸-碳原子上的羟基转变为酮基。酮基的形成促使了邻近C-C键的断裂，即有利于脱羧作用的

10、进行(-裂解)。-裂解是生物化学中最常见的一种C-C键的断裂方式。,3.3 异柠檬酸脱氢酶催化的生物学意义,异柠檬酸通过此酶催化的反应，使生物体解决了具有两个碳原子的乙酰基氧化和降解的问题。该酶所催化断裂的C-C键，并不是柠檬酸循环第一步反应里进入循环的乙酰基,而是连接该乙酰基的两个碳原子间的共价键。这共价键不能通过一般任何一种断裂方式打开。在二碳分子中也不能发生述的-裂解。相反，乙酰基一旦与草酰乙酸缩合，就形成对-裂解敏感的产物。,3.4 异柠檬酸脱氢酶,(1).高等动植物及大多数微生物中异柠檬酸脱氢酶有两类：一类 以NAD+为辅酶，存在于线粒体中，一类以NAPD+为辅酶，存在于线粒体和细胞

11、质中。(2).异柠檬酸脱氢酶是一个变构酶，活性受ADP变构激活(ADP能 增强酶与底物的亲和力)。该酶与异柠檬酸、Mg 2+、NAD+、ADP的结合有相互协同作用。NADH、ATP对该酶起变构抑制 作用。(3).异柠檬酸的转变有两条途径：一是当需要能量时，进行氧化 脱羧形成-酮戊二酸；二是在能量充足时，经异柠檬酸裂解 酶作用，生成琥珀酸和乙醛酸。,4.-酮戊二酸氧化脱羧成为琥珀酰-CoA,4.1 反应方程式,4.2 反应机制,-酮戊二酸脱氢酶系催化的每步机制和丙酮酸脱氢酶复合体相一致，需要TPP、硫辛酸、CoA、FAD、NAD+、Mg2+6种辅助因子。,(1).-酮戊二酸脱氢酶系与丙酮酸脱氢酶

12、复合体极其 相似，由-酮戊二酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酰转琥 珀酰酶(E2)、二氢硫辛酰脱氢酶(E3)组成。这里的E3与丙酮酸脱氢酶复合体的E3是一样的。而E1则与丙 酮酸脱氢酶复合体的E1不同，它不受磷酸化、去磷酸化共价 修饰调节。(2).-酮戊二酸脱氢酶受其产物琥珀酰-CoA、NADH 和高能荷的抑制。当细胞的ATP充裕时，柠檬酸循 环进行的速度便减慢。,4.3-酮戊二酸脱氢酶系,5.琥珀酰CoA转化成琥珀酸，并产生一GTP,5.1 反应方程式,琥珀酰-CoA硫酯键是一个高能键，它的断裂与鸟苷二磷酸(GDP)的磷酸化相偶联。,5.2 琥珀酰-CoA合成酶,(1).琥珀酰-CoA合成酶(也称

13、为称琥珀酰硫激酶)，其命名指的 是催化相反相反方向的反应，该反应极易向正反两方向进 行，但在柠檬酸循环中都是向形成琥珀酸的方向进行。(2).TCA循环中唯一底物水平磷酸化直接产生高能磷酸化合物 的步骤，反应中形成的GTP在生物合成中有特殊的作用。它参与信号的传递过程，还能通过琥珀酸-CoA合成酶和核 苷二磷酸激酶的偶联作用，使琥珀酸-CoA水解产生一 个ATP。,6.琥珀酸脱氢生成延胡索酸（反丁烯二酸）,6.1 反应方程式,6.2 反应机制,琥珀酸脱氢酶以FAD作为脱下电子的受体(不是NAD+)，因为其催化碳-碳键间的氧化，所释放的自由能不足以使脱下的电子转移到NAD+上。NADH再氧化的G=

14、-220.1KJ/mol，FADH2再氧化的G=-181.6KJ/mol。,6.3 琥珀酸脱氢酶,(1).它是柠檬酸循环中唯一嵌 入到线粒体内膜的酶，而 其它的酶大多存在于线粒 体基质中。(2).该酶直接与电子传递链相连，由琥珀酸分子上脱下的氢形成FADH2，后者直接将电子传递给琥珀酸-Q还原酶分子的Fe-S，氢的最终受体是氧分子。,7.延胡索酸被水化生成L-苹果酸,7.1 反应方程式,8.苹果酸脱氢生成草酰乙酸,8.1 反应方程式,8.3 苹果酸脱氢酶,苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等，所有已知的脱氢酶均具有立体结构的专一性，且都以NAD+作为电子受体。NAD+

15、与它们的结合方式很相似，虽然各种脱氢酶结构各异，但它们与NAD+结合的结构域也很相似。,五.柠檬酸循环的化学总结算,1.柠檬酸循环的总化学反应式:乙酰-CoA+3NAD+FAD+GDP+Pi 2CO2+3NADH+FADH2+GTP+2H+CoA-SH2.循环有以下特点：(1)、整个循环不需要氧，但离开氧无法进行。(2)、单向进行。(3)、乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，使两个C原子进入循环。在 以后的两步脱羧反应中，有两个C原子以CO2的形式离开循环，相 当于乙酰CoA的2个C原子形成CO2。(4)、在循环中有4对H原子通过4步氧化反应脱下，其中3对用以还 原NAD+生成3个NADH+H

16、+,1对用以还原FAD,生成1个FADH2。3NADH7.5 ATP;1FADH21.5ATP;(5)、由琥珀酰CoA形成琥珀酸时，偶联有底物水平磷酸化生成1个GTP,1GTP 1ATP,并消耗兩分子水。,3.总结算:(1).1分子乙酰CoA通过TCA循环被氧化，可生成10分子 ATP。(2).从丙酮酸开始，加上丙酮酸氧化脫羧生成的1个NADH，则共产生10+2.5=12.5个ATP。(3).从葡萄糖开始，共可产生12.52+7(或5）=32或30个ATP。,则一分子葡萄糖共产生:,25柠檬酸循环,+,2+2*2.5或1.5糖酵解,=32或30个,可见由糖酵解和TCA循环相连构成的糖的有氧氧化

17、途径，是机体利用糖氧化获得能量的最有效的方式，也是机体产生能量的主要方式。,六、柠檬酸循环的调控,柠檬酸循环的速度主要取决于细胞对ATP的需求量，另外也受细胞对于中间产物需求的影响。主要可分为两个方面的调控:1.柠檬酸循环本身制约系统的调节:1.1 调节循环速度的关键酶、关键底物：关键酶：柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和-酮戊二酸脱氢酶；关键底物：乙酰-CoA、草酰乙酸，NADH。,关键底物对关键酶的制约:,如柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、-酮戊二酸脱氢酶受NADH抑制：一般来说细胞对柠檬酸的利用速度总高于柠檬酸的合成速度，而 柠檬酸的利用速度受到以NAD+为辅助因子的异柠檬酸脱氢酶所控制。异柠檬酸

18、脱氢酶又受产物之一NADH的强烈抑制，故柠檬酸合酶也受NADH的抑制。同时，-酮戊二酸脱氢酶同样受产物NADH的抑制，如果NADH的浓度下降，-酮戊二酸脱氢酶的活性上升。,2.ATP、ADP和Ca2+对柠檬酸循环的调节,(1)ATP和ADP：机体活动增多时：ATP消耗更多，而ATP水解形成ADP，ADP是异柠檬酸脱氢酶的变构促进剂，从而增加该酶对底物的亲和力。机体活动减少时：ATP消耗减少、浓度上升，对该酶产生抑制效应。(2)Ca2+：在柠檬酸循环中它对丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和-酮戊二酸脱氢酶有激活作用。,七.柠檬酸循环中间产物的消耗与补充,由于柠檬酸循环具有分解化谢和合成代谢的双重性(

19、两用性)，除提供大量自由能之外，其中间产物更是许多合成代谢中的前体来源，由此柠檬酸中间产物可能外有额外的消耗，同时必须得到必要的补充。1）消耗：如-酮戊二酸 谷氨酸;草酰乙酸 天冬氨酸;琥珀酰CoA 卟啉环 2）补充：（1）有些降解途径可产生柠檬酸循环的中间产物。异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸分解琥珀酸-CoA 奇数脂肪酸氧化琥珀酸-CoA,异柠檬酸,琥珀酸CoA,苹果酸,草酰乙酸,CoASH,乙酰CoA,柠檬酸,丙氨酸苏氨酸甘氨酸丝氨酸半胱氨酸,丙酮酸,乙酰乙酰CoA,苯丙氨酸酪氨酸亮氨酸赖氨酸色氨酸,天冬酰胺天冬氨酸,-酮戊二酸,延胡索酸,苯丙氨酸酪氨酸,异亮氨酸甲硫氨酸缬氨酸,精氨酸组氨酸谷

20、氨酰胺脯氨酸,谷氨酸,碳骨架的氧化(肝脏中),TCA循环,奇数脂肪酸-氧化产生丙酰CoA，经羧化并异构形成琥珀酰CoA进入TCA。,.,（2）回补反应或填补反应(anaplerotic reaction)。属于这类型重要反应有:丙酮酸+CO2+ATP+H20 草酰乙酸+ADP+Pi+2H+反应酶为：丙酮酸羧化酶,思考题,1、名词解释：TCA循环；回补反应；-裂解2、试述丙酮酸转变为乙酰CoA和柠檬酸循环的具体反应历程，并指出：1）NADH、FADH2及GTP的产生情况；2）主要调节酶及其激活剂与抑制剂。3、能够催化底物脱氢，并以FAD为受氢体的酶是（）。A：乳酸脱氢酶 B：异柠檬酸脱氢酶 C:

21、琥珀酸脱氢酶 D：苹果酸脱氢酶 4、能发生底物水平磷酸化的反应有（）A：1,3二磷酸甘油酸3磷酸甘油酸 B：磷酸烯醇式丙酮酸烯醇式丙酮酸 C:琥珀酰-CoA琥珀酸 D：以上都是 5、三羧酸循环中草酰乙酸的补充主要来源于（）A：丙酮酸羧化 B：苹果酸脱氢 C:乙酰CoA缩和 D：天冬氨酸脱羧 6、丙酮酸氧化脱羧需要（）A:NAD+B：NADP+C：FMN D:CoQ 7、TCA 循环（）A：本身不会产生高能磷酸化合物 B：不受无氧条件的限制 C：循环起始物乙酰CoA中的2个C原子在一轮循环中以2个CO2形式释放 D:循环速率取决于对ATP的需求 8、三羧酸循环中草酰乙酸是什么酶作用的直接产物？（）A:柠檬酸脱氢酶 B：琥珀酸脱氢酶 C：苹果酸脱氢酶 D：顺乌头酸酶,