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1、2023/3/25,ELISA基础知识和注意事项,2023/3/25,类容,ELISA的基本原理和相关概念特别说说捕获法ELISA结果的影响因素ELISA结果的处理,2023/3/25,ELISA的基本原理和相关概念,将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或 抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。,2023/3/25,ELISA的基本原理,抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。,2023/3/25,抗原抗体复合物与酶标的
2、二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。,2023/3/25,ELISA的分类,测抗原：竞争法（也可用于测抗体）、双抗体夹心法。测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法,2023/3/25,竞争法elisa,竞争法ELISA原理标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，显色越浅。要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。,2023/3/25,2023/3/25,双抗体夹心法,双抗体夹心法ELISA 将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再加入
3、酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。检测测抗原要有至少具有2个抗原决定簇,2023/3/25,包被特异性抗体,2023/3/25,双抗原夹心法,双抗原夹心法ELISA检测标本中的总抗体（包括IgM和IgG型抗体）。将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加入底物显色,2023/3/25,2023/3/25,间接法,间接法 ELISA（Indirect ELISA）将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。酶标二抗是
4、针对一类免疫球蛋白分子只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗检测各种与抗原结合的抗体,2023/3/25,2023/3/25,捕获法,ELISA（Capture ELISA）专门用来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。,2023/3/25,2023/3/25,区别理解,检测抗原？抗体？包被什么？标记什么？,2023/3/25,间接法和捕获法比较,间接法：假阴性，假阳性捕获法：酶标抗体的要求较高,2023/3/25,间接法的假阳性,
5、2023/3/25,间接法的假阴性,麻疹IgG,麻疹抗原,麻疹IgM,酶标抗人IgM抗体,阳性结果,假阴性结果,2023/3/25,ELISA的有关名词概念,质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意质控血清只能用于质控活动，不可用于标定仪器或评价方法。用于室内质控的质控血清一般选取CUTOFF值2-3倍的质控品。,2023/3/25,室内质控：
6、实验室内部使用控制实验结果可靠性的一种质量控制。室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性的一种考核，可分为国家级和地方级的室间质评。可以理解为“各个实验室的质量评比”。,2023/3/25,临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳性或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方法。本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色的情况。ELISA 抗HBcAb，阳性不显色，阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况。,2023/3/25,灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。相对灵敏
7、度=真阳性/（真阳性+假阴性）100%测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率。,2023/3/25,特异性：真阴性标本的检出能力。相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）100%测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率。,2023/3/25,Elisa结果的影响因素,试剂盒的选择 标本 加样与稀释 温育 洗版 显色 质控,2023/3/25,试剂盒的选择,同行的试剂使用情况 上级部门对试剂实际使用的综合评价 使用临界值质控血清进行实际检测比较,选择林敏度和准确度高、特异性强试剂盒,2023/3/25,标本,应注意避免溶血 在5
8、 天内测定的血清标本可放置于4、超过一周测定的需20保存尽量避免反复冻融（少量分装）,2023/3/25,加样和稀释,加样本的准确性（个人因素和实验条件）尽可能排除主关因素（尽可能用加样枪，避免直接使用滴瓶）各种试剂盒标本的稀释使用，严格按照说明是操作,2023/3/25,温育,温度 水浴箱 发硬板应漂浮于水上或水面应高于反应板,2023/3/25,洗版,手洗 洗板机（微孔液体残留45s）,2023/3/25,显色,通常是A、B两种液体，不稳定，又颜色应立即丢弃 先加A后加B，显色时间严格按说明书进行 终止后15内比色,2023/3/25,质控,室内质控血清 即刻法,2023/3/25,ELISA试剂的常见问题原因及其解决,显色浅，灵敏度低 假阳性多，本底高甚至花板 重复性不好 白板,2023/3/25,显色浅 灵敏度低,2023/3/25,2023/3/25,假阳性多，本底高甚至花板,2023/3/25,2023/3/25,重复性不好,2023/3/25,白板,2023/3/25,结果处理,OD值出现负值 阴性对照值比空白小 样本OD值和cutoff接近,2023/3/25,OD值出现负值,波长不对，酶标仪上显示的波长和实际的滤光片不对应溶液里有沉淀板子脏了，如果有能冲洗的洗板机可以冲洗bottom，或者洗瓶冲干净用滤纸吸干，然后双波长检测,2023/3/25,the end,
