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1、19 双水相萃取,19.1 双水相的形成,亲水性的聚合物溶液熵增混合自发分子间作用力-随着Mr的增加,而增大.聚合物的不相容性-含有聚合物分子的溶液发生分相的现象.相图:相平衡时物系的组成,温度与压力的关系.,19.1 双水相的形成,双水相系统(aqueous two-phase system,ATPS),PEG=聚已二醇(polyethylene glycol),Kpi=磷酸钾,DX=葡聚糖(dextran),1、Pro如何分布2、影响因素3、应用,19.2 ATPS相图,双节线(bi-nodal)：图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS。系线(tie line
2、)：双节线上两点的直线。系线反映的信息A 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则B 性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小.C临界点(critical point)：当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。,19.3 蛋白质的分配平衡,1)分配系数m2)m贡献因子me、mb和ma分别为静电、疏水和亲和作用对溶质m的贡献.,3)、静电作用非电解质型溶质:电中性蛋白质的m0：式中,M:溶质分子量;:溶质在上下两相表面自由能的差,J/mol。意义：A不受静电作用的影响(因
3、不带电);B 一般 0，不同溶质lnm随M 而；CATPS不同,同一溶质的也就不同，m随ATPS不同而改变。图是不同pro在pH为各pro的pI的ATPS中的m,道南电位(,Donnan potential)实际ATPS中有电解质,当这些离子在两相中m 1),将两相间产生电位差 带电pro的m:意义：A荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比.B由于同一ATPS中添加不同的盐产生的不同,故m与Zpro的关系因盐而异。,4)疏水作用相间疏水因子(HF,hydrophobic factor)PEG/DX和PEG/KPi等ATPS上相(PEG相)疏水性较大,相间的疏水性差用HF表示.HF可通过
4、测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:RH-aa相对疏水性(relative hydrophobicity).是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=0.所以,上式中的B为:mGly为Gly分配系数.所以,pH=pL时aa在ATPS中的分配系数与其RH值呈线性关系,直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图为测定实例.,Pro表面疏水性(HFS,HF of surface)利用上式可确定不同ATPS的HF值.如在pH=pI的ATPS中,pro的m0与HF值之间呈线性关系,则直线的斜率定义为该蛋白质的HFS图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。图的结果示：pr
5、o的HFS随NaCl浓度的增大而增大。将盐对pro的HF影响上式得：其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。因此，m的一般形式,19.4 影响蛋白质m的综合因素,1)成相聚合物浓度和分子量分子量M:若降低聚合物的M，则pro分配于富含该聚合物的相中。如PEG/DX系统，若降低DX的M，则m减小。这一规律具有普遍意义。成相系统的总浓度：增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相.,存在问题：当系线长度增加时,系统的表面张力增大
6、,可能导致溶质在界面上的吸附.这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,.但对于可溶性蛋白质.这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑。,2)盐：图为各种离子在PEF/DX系统中的m.图示：HPO42-和H2PO4-(H1.5PO4-1.5)离子在PEG/DX系统的m小,因此利用pH 7的磷酸盐buffer很容易改变,使带负电pro有较高的m.HFS：盐的种类和浓度影响pro的HFS,从而影响pro的m。当盐的浓度很大时(如1mol/dm3),由于强烈的盐析，蛋白质的溶解度达到极限，表现分配系数增大，此时m与pro浓度有关。利用这一特点，
7、通过调节ATPS盐浓度，可选择性萃取不同的pro。不良影响：改变各相中成相物质的组成和相体积比。如PEG/Kpi系统中上、下相(或称轻重组)的PEG和磷钾浓度。,3)、pH valueA,(pH pI)value,pro(Z),lnm,B 交错分配法(cross partitioning):当加入不同种类的盐时，由于相间电位不同，lnmpH关系曲线也不一样。但在pro的pI处，由于Z=0，m应相同，即两条关系曲线交于一点。所以,通过测定不同盐类存在下 lnmpH曲线的交点,可测定蛋白质细胞器以及微粒的pI。CpH影响磷酸盐解离：即影响PEG/Kpi系统的相间电位和蛋白质的分配系数。对某些pro
8、,pH的很小变化会使m改变23个数量级。,4)温度 温度影响小,一般温度改变不影响产物的萃取。大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于：(1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性;(2)常温下溶液粘度较低,容易相分离;(3)常温操作节省冷却费用.,体系的选择和优化,1）体系选择的原则：基本公式：根据目标pro和共存杂质的HFSMpIZ等的差别,综合利用静电、疏水和添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。若目标产物与杂蛋白的表面疏水性HFS相差较大，充分发挥盐析作用；提高成相系统的浓度(系线长度)，增大ATPS的HF，也是选择性萃取的重要手段。,改变系线长度还
9、可以使细胞碎片选择性分配与于PEG/盐系统的下相；采用M较大的PEG可降低pro的m，使萃取到PEG相的pro总量减少，从而提高目标蛋白质的选择性。例如，采用6.3%PEG6000/10%Kpi系统,可从细胞匀浆液中将半乳酸糖苷提纯12倍,而使用低分子量PEG时,萃取的选择性降低17.此外,在磷酸盐存在下于pH7的范围内调节pH也可提高目标产物的萃取选择性.,在上述理论基础上,设计合理的试验,可确定最佳萃取系统.双水相萃取放大容易:一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模.因此,常利用多组10ml刻度离心管,进行分配平衡实验.具体实验步骤如下.(1)配制一系列不同浓度、pH及离子强度的
10、双水相,每个双水相改变一个参数.其中pH通常用磷酸盐缓冲液或氨酸调节.(2)加入料液,再加水使整个系统质量达到510g.离心管封口后充分混合;(3)在18002000g下离心35min,使两相完全分离;(4)小心地用吸管或移液管将上相和下相分别吸出,测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性,计算分配系数.上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活性测定中产生的系统误差。,19.5应用,1)蛋白质、酶的纯化2)多肽的分离纯化,3)核酸的分离纯化,4)、病毒、细胞、细胞器的分离,反胶束萃取（反胶团萃取）,1基本术语,胶束(micelles):向水中加
11、入表面活性剂，水溶液的表面张力随S增大而下降。当S达到一定值后，S缔合形成水溶性胶束,溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。胶团形成均是S分子自聚集的结果，是热力学稳定体系。自组装(self-assembly):自动有序聚集的过程临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC):S在水溶剂中形成胶束的最低浓度。,反胶束(reverse micelles):若向有机溶剂中加入一定浓度S，在有机溶剂中所会形成胶束。当形成反胶束时，水在有机相中的溶解随S线性增大。因此，可通过测定有机相中平衡水浓度的变化，确定形成反胶团的最低表面活性剂浓度。反胶束的形态：
12、球形或近似球形，也呈柱状。极性核(polar core):S分子的自组装形成了极性核。微水相或“水池”(water pool)：反胶束内溶解的水。,2基本性质,内水池直径d：反胶束的大小与溶剂和S的种类与浓度、温度、I等因素有关，一般为5-20nm，d用下式计算：W0-有机相中水与S的摩尔比，又称为含水率(water content)；M-水分子质量；asurf-界面处一个S的面积；N-阿弗加德罗常数。内水的性质：当W0较低(如S=AOT,W0=6-8)时,微水相的水分子受S亲水基团的强烈束缚,表观粘度上升50倍,疏水性也极高。随W0的增大,这些现象逐渐减弱,当 W016时,微水相的水与正常的
13、水接近,反胶团内可形成双电层。但即使当W0值很大,水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同,特别是在接近S亲水头的区域内。,AOT反胶团直径dAOT:常用于制备反胶束的S是二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠,商品名为Aerosol OT,即AOT。其在异辛烷中形成反胶团dAOT:第1项为水核直径，第二项(2*1.2 nm)为二倍AOT分子长度.一般反胶团的W0不超过40.因此,依据上式,利用ATO形成的水核直径一般不超过12nm,大致可容纳一个直径为5-10nm的pro分子.当pro分子比与反胶团直径相比大得多时(如,当M 100-200kD),难于溶解到反胶团中.,3反胶束的溶解作用,微水
14、池溶解和分离作用：反胶团的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子,为生物分子提供易于生存的亲水微环境.因此,反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。,蛋白质溶解模型：a、水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开；b、半岛模型：pro表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触；c、pro吸附于反胶团内壁；d、pro疏水区与几个反胶团的S疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。,3反胶束的溶解作用,溶解推动力A静电作用：理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反
15、之,则不能溶解到反胶团相中,左图为pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化,当pH,即在带正电荷的pH范围内蛋白质的溶解率接近100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用。,3反胶束的溶解作用,B空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应,含水率W0随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小,空间排阻作用增大,pro溶解下降.如，AOT/异辛烷系统的含水率与I-0.5成正比。图中W0与NaCl浓度关系为:图还示：AOT/异辛烷系统的含水率与AOT浓度无关,这是多数反胶团系统的共性.,在各pro的pI处(排除了静电相互作用的影响)，反胶团萃取实验研究表明:随着M增大,pro的分配系数(m,
16、溶解率)下降。当M 20KD时,m很小.表明随M增大,空间排阻作用增大,pro的溶解率降低.图的结果还表明,要据pro间M的差别可以选择性对pro进行萃取分离。C疏水性相互作用aa的疏水性各不相同,研究表明,除pH和I外,aa或肽的m随aa疏水性的增大而增大39.蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因而影响其分配系数.疏水性较大的pro可能以“半岛式”形式溶解。D分配系数m(or K):,4反胶束萃取的操作,A萃取的基本方法B 反萃取.,C 分级萃取,5反胶束萃取的影响因素,1)pH valueAOT=二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠。,2)盐浓度,盐浓度,W0,S&Pro Z,选择性,3)、盐离子的种类,4)蛋白质分子量M,5)、表面活性剂SA种类BS,6)助表面活性剂,6应用,1)蛋白质分离,6应用,2)胞内酶的提取,3)蛋白质复性(protein refolding),思考题,
