植物检验检疫实验实习报告册0426完整版植检.doc

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1、植物检疫实验实习报告册（病、草部分）院系： 班级： 姓名： 学号： 江西农大植保系植病教研室二零一零年目录植物检疫实验注意事项：实验一 产地检疫实验二 洗涤检验实验三、四 分离培养检验实验五、六 分离/染色检验实验七、八 接种检验实验九 植物病原线虫的分离 实验十 有害杂草实验十一 生理生化检验实验十二 染色检验实验十三 噬菌体检验教学实习植物检疫实验注意事项1、 每人准备HB和3H绘图铅笔个一支，橡皮一块，厘米尺和小刀各一把。江西农业大学实验报告纸数张。2、 实验前，预习实验指导书。3、 显微镜安指定号码使用，用完后复原，经教师检查后，放回原处。4、 实验过程中，必须保持安静，按照实验要求和

2、操作规程，认真进行实验。5、 实验报告要求正确、整洁、清晰，当天课后教师批改（教师指定的日期除外）。6、 实验完毕，将刀具、标本和剩余的实验材料放回原处，然后把实验桌和实验室打扫干净。7、 爱护实验用的各种仪器和用具，如有故障、顺坏和遗失，即使报告指导老师，进行登记，按规定处理。实验一 产地检疫一、目的通过本实验，掌握常见检疫性病害的产地检疫方法。二、材料与用具水稻细菌性条斑病、水稻白叶枯病、葡萄根癌病、棉花黄萎病（与棉花黄萎病比较）、柑橘溃疡病（与柑橘黄斑病，柑橘疮痂病比较）、柑橘黄龙病、甘薯瘟病、毒麦、豚草、劈杆刀等。三、内容（一）水稻细菌性条斑病英名：Bacterial leaf str

3、eak of rice学名：Xantnomonas oryzae pv. oryzicola 1、检疫时间：秧田：四叶期本田：第一次拔节期；第二次，孕穗抽穗期；第三次，齐穗叶片枯黄前。2、检疫部位：主要为叶片。3、田间检查方法：种子田逐块检查，主要依据症状，对不能确诊的可疑病株，带回室内进行“细菌溢”检查。4、检疫方法：病斑短条状，褐色、水渍状，对光半透明，病部菌浓多而小，鲜黄色不易脱落。镜鉴有“细菌溢”。5、出具证书。见附录I。（二）水稻白叶枯病英名：Rice bacterial leaf blight学名：Xantnomonas oryzae pv. oryzicola 1、检疫时间：秧田

4、：四叶期；本田：孕穗期前后。2、检疫部位：主要为叶片。3、田间检查方法：种子田逐块检查，主要依据症状，对不能确诊的可疑病株，带回室内进行“细菌溢”检查。4、检疫方法：4.1田间检查4.1.1田间检查时间4.1.1.1秧田从四叶期开始，逐畦目测检查，发现可疑病斑，拔出病苗，进行鉴定。4.1.1.2本田期检查三次：第一次在拔节期；第二次在孕穗至抽穗阶段，多为病害流行时期，症状明显，易于识别；第三次在齐穗后至叶片枯黄前，结合种子纯度、质量检验同时进行。4.1.2田间检查方法4.1.2.1检查方法：种子田逐块、逐带检查（包括隔离区）。4.1.2.2症状诊断：田间症状识别（详见附录B）。可疑症状，采集标

5、本带回室内鉴定。4.2室内检验方法4.2.1细菌溢检查：切取病叶上病健交界处叶片组织约1毫米，放在载玻片的水滴中，加上盖玻片，静止12min后，用手持扩大镜或低倍显微镜稍暗视野下检查，有云雾状菌液自叶脉涌出。4.2.2保湿检查：取玻璃杯一只，内盛清洁河沙约半寸深，加水湿润，再切取病叶组织约6.6cm，下端插入河沙中，上端外露，加盖湿纱布，保湿12h以上，上端切口处有混浊液或淡黄色菌珠形成。4.2.3染色检查：将病叶茎部剪去，插入盛有红墨水（原液或加稀释）的玻管或广口瓶中，放在通风而温暖的地方，30min后，健部染成红色，病部因导管内充满细菌，影响红墨水进入，仍为绿色或黄色。4.2.4分离培养检

6、验：对病组织进行分离培养细菌学检验。 4.3带菌种子检验：用噬菌体方法或免疫荧光检验方法检验种子带菌情况。（三）柑橘溃疡病英名：Citrus canker学名：Xanthomonas campestris pv. citri1、检疫时间：夏稍转绿后；秋稍转绿后；苗木出圃前，共检查三次。检疫部位，叶片、枝条、果实2、检疫要求：在全面目测检查的基础上，用随机取样法检查（取样在10个以上），苗木在一万株以下全部检查，1万到10万株检查30%；10万以上检查15%。3、检疫主要依据：病斑呈火山口状，中央凹陷，四周隆起，表面粗糙，叶片病斑可穿透正反两面，黄色晕圈宽晕圈处有褐色的袖边，枝条上病斑无黄晕圈，

7、果实上病斑比叶片大，只发生在果皮上，此病可引起落花落果。镜鉴有“细菌溢”。柑橘溃疡病与柑橘黄斑病初期症状容易混淆，鉴定时应特别注意：溃疡病：叶片正反两面木恮化程度高，病斑中央凹陷，呈火山口症状明显，病斑后期中央虽然可变成灰白，但是不产生黑色小点，镜鉴有细菌溢出。黄斑病：叶背病斑稍隆起，病斑中央凹陷不明显，叶正面病斑不定型，不隆起或稍隆起，没有火山口状开裂。后期病斑中央变灰白色，其上可产生许多黑色小点（病菌的分生孢子器）。果实上病斑相似，制片镜鉴无细菌溢出。4、鉴定经过田间和室内检查，未发现溃疡病的苗木，可以鉴发“柑橘苗木产地检疫合格证”，见附录IV，准予苗木出圃。（四）柑橘黄龙病英名：Citr

8、us HuangLongbing学名：Rickettsiae-like organism gloeosporioides Penz 简称RLO；1、检疫时间：与柑橘溃疡病类似；2、检疫部位，叶片、枝条、果实；3、检疫要求：在全面目测检查的基础上，用随机取样法检查（取样在10个以上），苗木在一万株以下全部检查，1万到10万株检查30%；10万以上检查15%；4、检疫主要依据：初期典型症状是在浓绿的树冠中发生12条或多条的枝梢发黄；病果小，畸形果脐歪斜，果皮光滑，无光泽，味酸，着色时有的黄绿不均匀，有的品种果蒂附近变橙红色，俗称“红鼻子果”；根部症状主要表现为根的腐烂，其严重程度与地上枝梢相对称。

9、（五）棉花黄萎病英名：Cotton Verticllium wilt学名：Verticllium dahliae 1、检疫时间：花铃期（78月份）2、检疫部位：叶片、茎杆3、检疫要求：全面调查，块块查到，一株不漏，后期劈杆检查量：株行圃50%，株系圃100%，原种圃和繁殖基地可根据上段检查疑点进行抽样剖查，隔离观察圃的新材料要求全部剖杆检查。4、检疫主要依据：叶缘或主脉间叶肉变黄，叶脉仍为绿色，形成掌状斑，秋季多雨时，叶片病部可产生白色粉状霉层。劈杆检查，维管束变褐色，变色程度比棉花黄萎病浅。5、 签证：根据室内外检查结果，填写“棉花种子产地检疫合格证”，见附录II。（六）甘薯瘟病英名：Bla

10、st of sweet potato学名：Pseudomonas batatae cheng and Fang1、检疫时间：苗床期：种苗出圃前（4月中5月上旬）选择晴天中前后进行大田期：移栽后2030天，薯蔓未长出不定根时（6月下7月上旬）晴天中午前后进行检查薯块（10月下11月上旬）2、检疫部位：叶片：茎基部维管束，薯块维管束。3、检疫要求：在全面目测的基础上，采取随机取样方法检查，每块种苗抽查五点以上，每点不少于200株，薯块不少于200块。4、检疫主要方法：（1）叶片萎焉、叶色不变，全株迅速萎焉；（2）薯蒂附近呈黑褐色（3）茎基部维管束变为黄色或黄褐色（4）薯块维管束变色，呈分散的褐色小

11、点，（横切）或褐色条纹，（纵切），病薯汁液少，有刺鼻臭味。（5）、镜鉴有“细菌溢”。5、鉴证：根据室内外检查结果，开具“甘薯种苗产地检疫合格证书”，见附录III。（八）豚草英名：Ragweed学名：Ambrosia artemisiifolia Linn.1、检疫时间：春末，夏，秋2、检疫部位：茎，叶片，种子等。3、检疫方法：产地检疫；室内检验；4、症状：室外主要根据症状进行鉴定。草本，茎下部叶对生，上部叶互生，叶一至二回羽裂，边缘具小裂片状齿。雄花序总苞碟形，排成总状，雌花序生雄花序下或生上部叶腋。(九)毒麦：英名：Darnel Rye-grass， Poison Darnel学名：Loli

12、um temulentum L1、检疫时间：抽穗期（3月底4月初）2、检疫部位：穗，籽粒，叶片等。3、检疫方法：室内取检验样品至少1000g，按照毒麦籽粒特征，从小麦里分检出来，并计算混杂的百分率。4、症状：室外主要根据症状进行鉴定。毒麦籽粒含有毒麦碱，能麻痹中枢神经，引起人畜中毒，吃含4%毒麦的面粉就能引起头晕、昏迷、恶心、呕吐、痉挛等症状。毒麦为一年生杂草，外形似小麦，幼苗基部紫红色，后变为绿色，在肥沃田中比小麦矮，在瘠薄田中比小麦高，叶片较薄，叶背光滑，叶面较粗，叶脉明显，穗形扁而狭长，穗抽平滑，两侧有轴沟，呈波浪形弯曲，穗比小麦长，穗上有819个小穗，互生于穗轴上，每个小穗有26个花，

13、排成两列，小穗以稃片的背腹面对穗轴，第一颖缺，第二颖大，先端尖而宽，具59脉，外稃椭圆形，先端钝，芒长715mm，内稃与外稃等长，籽实被内，外稃紧包，籽实长椭圆形，坚硬无光泽，灰褐色，腹沟较宽。四、作业：1、在田间如何诊断水稻细菌性条斑病和水稻白叶枯病？绘“细菌溢”图。2、产地检疫时，如何诊断棉花黄萎病？3、柑橘溃疡病与疮痂病、黄斑病的症状有何异同？4、江西检疫性有害杂草有哪些？危害如何？附录I 种子产地检疫合格证检疫日期 年 月 日 字第 号作物名称品种名称种苗来源田块数量繁殖面积提供种苗数量繁殖单位负责人检疫结果检验人产检字第 号 种子产地检疫合格证检疫日期 年 月 日 字第 号作物名称品

14、种名称种苗来源田块数量繁殖面积提供种苗数量繁殖单位负责人产地检疫结果 检疫人附录II棉花种子产地检疫合格证检疫日期 年 月 日 字第 号品种名称繁殖数量（kg）繁殖单位负责人检疫结果： 检疫人：地或县植检部门审查意见 （盖章）注：1、棉种调运时可持本证由植检机关换取植物检疫证书2、同一个良种繁殖区，同一品种，同批次出具的产地检疫合格正当年有效。附录III 甘薯种苗产地检疫合格证植检字 号申请检疫单位（个人）育苗时间：20 年 月 日至20 年 月 日品种 繁殖面积 预计总产（kg/株）田间调查次数 室内调查次数检疫结果：审批意见：经产地检疫符合国家健康种苗标准，准予做种用，特发此证 检疫机关（

15、盖章）检疫员： 签证 年 月 日注：（1）本证一式三联，第一联为存根，第二联交至种单位（农户）;第三联交种子收购部门（或用户）（2）本证书只限本单位（户）该批种薯使用，不得转借他人或弄虚作假，否则以违章调运论处。（3）本证书不做检疫证书使用（4）调往外县的种苗，可凭此证书向当地植检部门换取检疫证。附录IV柑橘苗木产地检疫合格证（存根） 产检字 号苗圃 年培育 柑（橘） 苗株经田间 或室内检验，未发现柑橘检疫病害，同意出圃。 检疫员 年 月 日 柑橘苗木产地检疫合格证 产检证字 号 苗圃 年培育的 柑（橘）苗 株，经产地检疫合格，同意出圃。 植物检疫员 检查员 （植物检疫机构公章） 20 年 月

16、 日注：（1）本证不能代替检疫证书使用（2）同品种、同批苗木出具的产地检疫合格证当年有效。实验二 洗涤检验一、目的：通过此实验，掌握植病检疫中洗涤检验的一般方法。二、材料与用具：显微镜、离心机、天平、三角瓶、接目测微尺、接物测微尺、席尔氏缓冲液、载玻片、盖玻片、滴瓶、滴管、纱布，带小麦矮腥黑穗病均小麦种子。三、检验方法：1、检取平均样品：若检验货轮，万吨左右的小麦，每舱分上、中、下、三层，检取平均样品三份，若货装2万吨以上的小麦，每舱分四层，检取平均样品三份，每份样品数量为1公斤。2、捡取检验样品：在每份平均样品中，随机捡取一份式样，每份50克，供洗涤检查用。3、洗涤检查：捡取检验样品50克与

17、三角瓶中，加入100ml无菌水（或蒸馏水），加塞后用力振荡5分钟，立即将悬浮液注入1015ml的离心管以每分钟1000转的速度离心5分钟，必要时，可重复离心一次。将上层清液全部倾去，将沉定液倒入小型培养皿（或在原离心管中）加入数滴席尔氏液，然后制片镜鉴，每份样品检查5块玻片。4、 孢子测量测量内容：包子大小、网目宽、网脊高、胶质鞘厚度等，一般每船测量30左右的包子。小麦矮腥黑穗病菌与小麦网腥黑穗病菌的冬孢子非常相似，但是在测量内容的各项中均有区别，本实验每人各测量小麦矮星黑穗病菌、小麦网腥黑穗病菌冬孢子各10个。附I、缓冲液的配制（1）席尔氏缓冲液将2%的醋酸钾溶于麦克凡氏PH8缓冲液300m

18、l；甘油120ml；乙醇180ml内。（2）麦克氏缓冲液A、配制0.1克分子柠檬酸将21.008克水和结晶柠檬酸溶于500ml蒸馏水中，再加入纯净的中和性甲醇，总量达1000ml（需小心混合）。B、配制0.2克分子磷酸一氢二钠将28.40克磷酸一氢二钠，溶于500ml蒸馏水内，加甲醇至总容量为1000ml。取0.1克分子柠檬酸0.55ml与0.2克分子磷酸一氢二钠19.45ml混合，即成麦克凡氏PH8缓冲液，甲醇可用蒸馏水代替。附II：接目测微尺计测法接目测微尺是一刻有刻度的圆形玻璃，上边每一格所代表的距离因显微镜放大倍数好镜筒的长短而不同，所以要用镜台测微尺准定后才能使用计测。镜台测微尺是一

19、块玻片，中央有一圆圈，圈内刻有一尺，长度是一毫米，分为10个大格，100个小格，故每一小格为0.01mm或10um。准定接目测微尺的步骤如下：1、将显微镜同调节固定位置。2、将接目测微尺放在节目境内，有镜头向下看，上面的格纹看得很清楚。3、将镜台测微尺放在镜台上；4、先用低倍镜观察，当镜台测微尺上的任何两条线与节目测微尺的任何两条线相重叠时，即记下每一尺上的格数，如此观察三次。计算接目测微尺每格的长度：接目测微尺每格的长度=镜台测微尺三次重叠格数总和10接目测微尺三次重叠格数的总和3、 用同样的方法，在高倍镜下准定接目测微尺每格的长度准定的数值只适用于固定的显微镜，当接目测微尺在另一台显微镜上

20、或在同一显微镜上但镜头有所改变时，必须重新准定。四、 作业1、以表格的形式计算你在实验中用到的接目测微尺每格的长度。2、将测量结果整理成表。冬孢子大小测量结果记录孢子号孢子大小(m)网脊高度值(m)网目大小(m)01020304050607080910平均数值实验三、四 分离培养检验一、目的：通过本实验，掌握棉花黄萎病种子带菌（或病茎）、柑橘黑斑病病果、叶等检疫性真菌病害的分离检验方法。二、材料与用具待检棉籽或新鲜可疑病株茎杆或柑橘黑斑病病果，浓硫酸、玻璃缸、玻棒、细孔竹筛、选择性培养基或PSA培养基、灭菌培养皿、酒精灯、镊子、解剖剪刀、小酒杯、玻璃蜡笔、火柴、无菌水、70%酒精、0.1%升汞

21、液、培养箱等。三、方法（一）棉籽带菌检验1、配制选择性培养基选择性培养基成分表甲基纤维素1克五氯硝基苯0.1克蛋白胨5克蔗糖20克磷酸氢二钾1克琼脂20克硫酸镁0.5克蒸馏水1000ml硫酸铵0.3克链霉素0.1克氯化钾0.6克偏重亚硫酸钾0.2克（注：甲基纤维素、链霉素、制霉素、均在灭菌后加入，不加也可以，气温高，霉菌多时加入）。2、取样将待检棉籽按总件数的110%抽取平均样品，每份平均样品为1000克，将平均样品混匀，倒在白瓷盘内，铺成正方形，按对角线分成4个等边三角形，除去相对两个三角瓶的棉籽，重复上述操作，直到2个三角形的棉籽约达到1000粒，为检验样品，本实验每人取检验样品棉籽20粒

22、。3、分离程序（1）分离前，用0.1%新洁尓液侵手消毒12分钟。然后脱脂棉 70%酒精檫手。（2）点燃酒精灯每人取灭菌培养皿三幅，用玻璃蜡笔在培养皿盖的侧面注明分离者的姓名、日期以及分离材料名称。（3）在无菌条件下，每个培养皿中加入25%乳酸12滴，将溶化后冷却至46C的培养基倒入培养皿中（每皿倒一管），轻轻旋动，使成平板，用同样的方法，制三个平板。（4）棉籽消毒A、棉籽-70%酒精中30s-0.1%升汞23分钟-无菌水洗3次（每次1015分钟）B、棉籽-20%漂白粉液中侵35min，无须冲洗C、棉籽-放入大三角瓶中，瓶口罩上铁网或纱布，取橡皮管一段，一端连在自来水龙头上，另一端接波管，插入三

23、角瓶中，开放龙头，在流水下冲洗24小时。D、在消毒过或冲洗过的种子，用面均镊子移入培养皿平板中。每皿放5粒。E、将培养皿翻转，置于25-27温箱中培养。F、培养七天后，从菌落上挑取病菌制片镜检，并测量大型分生孢子（三个隔膜）的大小。（二）可疑病株茎杆检验1、培养基：可用选择性培养基，成分同上，也可用PSA培养基，PSA培养基成分：马铃薯200克蔗糖15-18克琼脂18克蒸馏水1000ml2、取样在田间，将可疑病株取回，去除枝叶，取茎基部茎杆，剥去表皮用解剖剪剪成0.5C的小块（段）。3、分离分离程序同棉籽。消毒方法同（一）（三）柑橘黑斑病病果、叶检验：同上。四、分离中应注意的几个问题1、分离用

24、的一切用具，如小酒杯、剪刀、镊子、移植环（或接种针）等都必须蘸酒精火焰上灭菌23次再用。2、分离过程中，必须严格无菌操作手续，再倒培养基，制平板，用无菌水洗涤消毒材料，以及把消毒材料放入培养皿内的平板上等环节，都必须靠近火焰进行。3、倒培养基和制平板时，动作要轻，不要把培养基沾在皿盖或培养皿外面。五、作业1、根据实验结果，写出实验报告并填写检验报告单。棉黄萎病菌室内检验报告单单位： 检验人：应检对象检验材料（组织种子）检验数量（块、粒）检验方法结果统计带长率（%）备注2、根据实验镜检结果，绘出分离物形态图与病原物形态图比较，并分析结果。实验五、六 分离/染色检验一、目的：通过本实验，掌握柑橘溃

25、疡病等检疫性细菌病害的分离检验方法。二、材料与用具待检柑橘溃疡病病果或病叶，浓硫酸、玻璃缸、玻棒、细孔竹筛、选择性培养基或PSA培养基、灭菌培养皿、酒精灯、镊子、解剖剪刀、小酒杯、玻璃蜡笔、火柴、无菌水、70%酒精、0.1%升汞液、培养箱等。三、方法1、NA(牛肉膏蛋白陈培养基)培养基：pH7.0牛肉膏 3g，蛋白胨 5g，葡萄糖 20.0g琼脂 17g蒸馏水 l000ml2、分离：取灭菌的培养皿三个，每个培养皿中加灭菌水约0.5 ml。切取约4mm的小块病组织，经过表面消毒和灭菌水洗过三次以后，移在第一个培养皿的水滴中。用灭菌的玻璃棒将病组织研碎，静置1015 min，使病组织中的细菌渗入水

26、中（配成悬浮液），然后用灭菌的移植环从第一个培养皿中移植三环到第二个培养皿中，充分混合后再移植三环到第三个培养皿中。然后，将熔化的NA培养基冷却到45左右，倒在三个培养皿中。冷却凝固后，将培养皿翻转，在25下培养。3、革兰氏染色：（1）涂片：将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1-2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（2）染色：初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗；媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗；（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20-30 秒钟，立即用水冲净酒精。（4

27、）复染用番红液染1-2 分钟，水洗。（5）镜检干燥后，置油镜观察革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。五、作业根据实验结果，描述可能分离到的柑橘溃疡病菌的生长形态及染色情况，分析分离结果。实验七、八 接种检验一、目的：通过本实验，掌握用接种检验方法鉴定水稻白叶枯病。二、材料与用具水稻幼苗，水稻白叶枯病菌，NA培养基，剪刀，酒精灯，火柴，蜡笔等。三、方法1、水稻幼苗培养：教师课前准备。将水稻土浸泡15d，底肥施复合肥(10g/盆)。水稻白叶枯病感病种子于28下浸种2d，催芽2d，然后将其点播至塑料盆中，每行3兜，每兜8颗种子，共

28、4列。于温室下进行水肥栽培管理。2、水稻白叶病菌培养：教师课前准备。水稻白叶枯病的分离方法与一般植物病原细菌的分离方法相同，只是在培养基中以蔗糖代替葡萄糖，分离后的培养皿先在2025温箱中存放一天以后转入2729的温箱中培养，而菌落的出现一般都要37天以后。3、水稻白叶病菌接种用灭菌剪刀蘸取白叶枯病菌液菌液，剪去幼苗第5或者第6叶尖1cm。以接种无菌水为对照。每个接种6-7个叶片。温室环境为，温度28，日照时间16h，暗照为8h。盆内保持水层3cm厚，以利于白叶枯病的发生。15d后观察并统计发病情况。4、病情分级标准接种后第15d调查病害情况，每处理测量被剪水稻叶片的病斑长度和叶片全长，按表2

29、-1要求级标准记载病情。计算病情指数，具体计算方法如下公式: 表1 水稻白叶枯病剪叶接种发病等级标准级别发病程度描述0剪口处无病斑1剪口处有很小病斑，很少下伸，长度不超过2一3cm2病斑向下扩展3cm以上，病斑占剩余叶面积的1/4左右3病斑占剩余叶面积的1/2左右4病斑占剩余叶面积的3/4左右5全叶发病，有时叶鞘也枯黄5、从发病植株上重新获得水稻白叶病菌 充分保湿后，在发病叶片上有菌脓，或可以观察到细菌溢，根据发病症状并重新培养获得水稻白叶病菌。四、作业 根据实验结果，如何确定水稻白叶病菌？实验九 植物病原线虫的分离 一、目的要求 了解从土壤和植物组织中分离线虫的基本原理，掌握从土壤和植物组织

30、中分离线虫的常用方法。学习在解剖镜或扩大镜下用镊子、竹针、毛针、毛笔等工具从水中和滤纸上挑取线虫的方法。 二、基本原理 植物寄生线虫主要存在于土壤和植物组织中，分离线虫的方法有许多，要根据线虫的种类、研究目的等来选择适宜的方法。植物寄生线虫的个体很小，除极少数可从植物组织中直接挑出以外，绝大多数需借助特定的工具和方法才能完成。线虫的分离主要是利用它的趋水性、大小、比重以及与其他杂质的差异，采用过筛、离心、漂浮等措施，将线虫从植物组织、土壤中分离出来。 三、材料、试剂与仪器 1实验材料 感染根结线虫病的植物病根、病土、感染大豆孢囊线虫或其它孢囊线虫的病土、感染甘薯茎线虫的病薯块等。2仪器或实验用

31、具 解剖镜、漏斗分离装置、漂浮分离装置、浅盘分离装置、纱布或铜纱、记数皿或平皿、小烧杯、小玻管、旋盖玻璃瓶、40目和325目网筛、线虫滤纸、餐巾纸、挑针、竹针、毛针、毛笔等。 3试剂 线虫固定液。 四、实验操作 1直接观察分离对于个体较大的线虫如根结线虫、孢囊线虫、粒线虫的雌虫等，可直接用挑针从植物组织中挑取，也可在解剖镜或扩大镜观察下直接挑取，对于虫体稍小的线虫如茎线虫、粒线虫的雄虫和幼虫等，需在解剖镜下，用竹针或毛针直接挑取。 取感染根结线虫的植物病根材料（若是干材料需用水浸泡过夜），剥开皮层，观察里面是否有针头大小、乳白色发亮的颗粒状物。用挑针挑取，置凹玻片上水滴中，在解剖镜或显微镜下观

32、察是否为根结线虫雌虫。 2漏斗分离法该方法操作简单，是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。其装置是将直径10 15cm 的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约 10 cm 的橡皮管，橡皮管上装一个弹簧夹。 （1）将植物材料切碎用双层纱布包好，浸在盛满清水的漏斗中，或在漏斗内衬放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将植物材料直接放在网筛中，分离土壤线虫时需在网筛上放一层纱布或多孔疏松的纸，上面加一层土样。（2）加水，静止24h。提示：由于趋水性和自身的重量，线虫就离开植物组织或土壤，沉降到漏斗底部的橡皮管中。（3）打开弹簧夹，慢慢放出底部约5 ml水样于平皿内。（4）在解剖镜下观察分离到的线虫。若线虫数量

33、太少，可将水样倒入离心管中，在1500rpm离心机中离心3 min，倒掉上层清水，将下层沉淀物悬浮后倒入平皿或记数皿中，在解剖镜下观察记数，然后将线虫用毛针或毛笔挑入盛有固定液的小玻璃管中备用。提示 该方法也可用于分离土壤中的线虫，尤其是分离较为活跃的线虫。 3培育分离法对于用漏斗分离法不易分离到的线虫，如根结线虫和孢囊线虫的雄性成虫等，可采用培育分离法。 将病根采回后洗去表面土粒，放在培养皿中湿润的滤纸上培育3d，用少量清水冲洗组织和皿底，检查水中线虫。或将组织放在有螺旋盖的玻瓶中，加入几毫升清水，盖不要旋紧，在室温（20 25 ）下培育3d，然后加50 ml清水，盖紧盖子并轻轻振荡，后倒出

34、悬浮液使其顺序通过40目和325目网筛，用小水流轻轻冲洗325目网筛背面，收集到记数皿或烧杯中，直接检查或离心后检查。 提示 从土壤中得到病根后要马上冲洗和培育，因为24h后，有50%的线虫会从根里爬出，冲洗时便被冲掉了。 4浅盘分离法该方法原理与漏斗分离法一样，但分离效果更好，而且泥沙等杂物较少。用两个不锈钢浅盘套放在一起，上面一个是筛盘，它的底部是筛网，网目大小为10目/英寸，下面一个是稍大的盛水盘。也可在培养皿上放置一个稍小的做成浅盘状的金属网，网与培养皿底部保持一定距离。 分离时将线虫滤纸放在网上用水淋湿，上面再放一层餐巾纸，将要分离的土样或植物材料放在餐巾纸上，在两盘之间缝隙中加水，

35、淹没土样或植物材料，在室温（20 25 ）下保持3d，去掉筛网后，将下面浅盘中的水样过筛（上层为25目，下层为400目），将下层筛上的线虫用小水流冲洗到记数皿中，观察记数。 5漂浮器分离法对于没有活动能力的孢囊线虫的孢囊可采用漂浮器分离法（Fenwick-Oostenbrink改良漂浮法），该法需要特制的分离装置。分离时先将漂浮筒内盛满清水，将 100g 风干的土样放在上筛中，用强水流冲洗土样，使其全部洗到漂浮筒内，并从环颈水槽流到承接的细筛（100目）中，再用细水流冲洗一会，使漂浮物全部流入细筛。将细筛中的孢囊等漂浮物用水洗入烧杯或三角瓶中，再倒入铺有滤纸的漏斗中，用毛笔收集并观察滤纸上的孢

36、囊。 五、所需时间流程 1漏斗分离 样品浸泡放出水浸液、离心镜检 2培育分离 样品培育过筛、收集、镜检 3浅盘分离 样品浸泡样过筛、收入记数皿、镜检 4漂浮分离 10 min左右。六、实验作业 1、比较各种线虫分离方法的优缺点。2、绘线虫形态图。附录：松材线虫检疫技术操作办法1 主题内容及应检范围1.1 本办法规定了松材线虫Bursaphelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer) Nickle 的检疫检验及检疫处理操作办法。1.2 本办法适用于林业植物检疫机构对松科植物中松属Pinus spp.、冷杉属Abies spp.、云杉属Picea spp.、雪松属

37、Cedru spp.s、落叶松属Larix spp.植物的树木、枝条、伐桩、木材（含原木、锯材、切片）及其制品（含包装材料、电缆盘等）的检疫检验和检疫处理。2 产地检疫2.1 踏查2.1.1 在由松科植物构成的，或以松树为主的生态林、用材林，特别是有松树栽植的风景名胜地，疫情发生区及毗邻地区，曾调入染疫木材（含原木、锯材、切片）及其制品的城镇、工矿企业、交通干线附近、无线通讯台站、广播电视信号台站、电力线路、仓库、码头、车站、驻军营房、贮木场及加工场（点）、集贸市场，以自然界线、道路为单位进行线路（目测）调查。2.1.2 调查松树的针叶是否有黄绿色、黄褐色、红褐色萎蔫，是否整株枯死或未全部变红

38、仍有部分呈绿色；枯死树针叶在小枝上当年不脱落（如黑松、马尾松等）或脱落（如思茅松）；树脂分泌急剧减少，甚至停止；材质干枯，有蓝变现象。2.1.3 调查松树是否有天牛危害的羽化孔、侵入孔、蛀道等痕迹。2.1.4 需进一步确定疫情的，应取样进行分离鉴定。2.1.4.1 在树干的下部（胸高处）、中部和上部（主侧枝交界处），用斧子、柴刀、木锯或木钻（钻头直径1-1.5 cm）在木质部采集样品。2.1.4.2 取样时在取样部位剥净树皮和外围木质部，直接砍取100-200 g木片；或剥净树皮和外围木质部，用手摇钻从木质部至髓心钻取100-200 g木屑；或在取样部位分别截取圆盘。样品标签须填写清楚（包括采

39、集地点、寄主、时间、采集人），与样品一起放入塑料袋内，用橡皮筋扎紧，带回室内检验。2.2 贮木场及加工场（点）、集贸市场调查2.2.1 木材（含原木、锯材、切片）及其制品采取楞垛表面或分层方式设点抽样调查。2.2.2 调查数量每批次按总量（m3、垛）的5%-10%抽取，疫情严重的应全部进行抽样调查。2.3 疫情监测2.3.1 定期普查2.3.1.1 对辖区内由松科植物构成的，或以松树为主的生态林、用材林以及松木贮木场及加工场（点），或人为活动频繁的公路两旁松林，应进行定期普查。2.3.1.2 每年3-5月和8-10月，应对上述地区的松林进行全面普查。2.3.2 人工监测2.3.2.1 在疫情发

40、生区及毗邻地区，在当年秋季刚刚枯死的病树树干下部（胸高处）、中部和上部（主侧枝交界处），剥净树皮，选取靠近蛀道、蛹室部位，用手摇钻钻至树心，取松木木屑（100-200 g）进行分离鉴定。2.3.2.2 对已确定发现松材线虫的林分，应对周围松林进行全面调查，以确定疫情发生范围。2.3.3 打孔流胶法监测2.3.3.1 对于松材线虫发生区或其边缘的松树，若外观正常，针叶无明显变色可以用打孔流胶法做初步诊断，要确定是否感染了松材线虫还需进行取样分离诊断法进行确认。2.3.3.2 使用锤子和打孔器或铳子（直径10-15 mm）在松树主干上打一可见木质部的圆孔，位置和方向不限。2.3.3.3 在春、夏、

41、秋季，打孔后24 h即可进行观察；在冬季，打孔后48-72 h进行观察。2.3.3.4 观察打孔后松树流脂情况，按下述标准确定流胶级别。 一级流胶：树脂从孔口流下，渗出量很多； 二级流胶：树脂从孔口流下，渗出量较多； 三级流胶：树脂沉积在孔口下缘； 四级流胶：树脂渗出到圆孔壁上，呈粒状； 五级流胶：孔壁上无树脂流出。2.3.3.5 对于三至五级流胶的松树，按2.1.4进行取样分离鉴定。2.3.4 天牛引诱剂监测2.3.4.1 于松褐天牛羽化期，在通风良好便于观测的山顶或林道旁设置诱捕器。诱捕器距地面高度不得低于1.5 m，诱捕器间距50-100 m。2.3.4.2 羽化高峰期1d检查1次，其余时间每隔3-5 d检查1次。将诱捕到的松褐天牛活体进行分离