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1、第九章 肝胆生化及检测,第一节 概 述,一、肝脏结构,（一）解剖学特点,双重血液供应,腹主动脉的分技肝动脉,氧,门静脉,营养,双重输出管道,肝静脉,代谢降解物,下腔静脉,胆道系统,脂溶性物质及其代谢产物,体外,（二）肝脏的显微结构特点,1、组织结构,2、亚细胞结构,（三）细胞的再生,二、肝脏的生物化学功能,排泄功能物质代谢功能生物转化,重要生化功能,（一）排泄功能,主要排泄对象：胆汁酸、胆红素、氨,1、胆汁酸代谢,（1）胆汁的分泌：,胆汁功能：促进脂类的消化吸收，同时能将体内某些代谢产物及生物转化产物不断地排入肠道随粪便排出体外。,胆汁的来源：,肝胆汁 胆囊胆汁 十二指肠,胆汁的成分：,水/胆
2、汁酸（盐）、卵磷脂、蛋白质、脂肪酸和胆固醇,（2）胆汁酸生成及种类：,初级胆汁酸（肝细胞）次级胆汁酸（肠道）,初级游离胆汁酸初级结合胆汁酸（甘氨酸/牛磺酸）次级游离胆汁酸次级结合胆汁酸（甘氨酸/牛磺酸）,（3）胆汁酸肝肠循环：,（4）胆汁酸的功能：,促进脂类消化促进脂类吸收抑制胆固醇从胆汁中析出沉淀,游离型胆汁酸,结合型胆汁酸,2、胆红素代谢,胆色素,尿胆素原 粪胆素原尿胆素粪胆素胆绿素胆红素,未结合胆红素(单核吞噬细胞系统如骨髓、脾脏),结合胆红素（肝脏）,胆素原,部位肝脏细胞,鸟氨酸,瓜氨酸,瓜氨酸,精氨酸代琥珀酸,ATP,AMP+PPi,延胡索酸,鸟氨酸,精氨酸,H2O,尿素,天门冬氨酸
3、,NH3,CO2,氨甲酰磷酸,+H2O,尿素循环,（二）物质代谢功能,1、营养物质代谢,2、激素及维生素代谢,(1)在蛋白质代谢中的作用(2)在氨基酸代谢中的作用(3)在糖代谢中的作用(4)在脂代谢中的作用,激素的灭活主要在肝脏进行,多种维生素能在肝细胞内储存并进行转化,三、肝脏疾病的生化改变,（一）胆红素代谢障碍（黄疸）,定义:,黄疸分类:,黄疸,和阻塞性黄疸,溶血性黄疸,肝细胞性黄疸,高胆红素血症,（二）胆汁酸代谢障碍,1、胆汁酸合成障碍2、胆汁酸向肠道排出障碍3胆汁酸肠肝循环紊乱4胆汁瘀积病变时胆汁酸代谢紊乱,（三）血浆酶异常,1肝脏合成酶类:胆碱脂酶、凝血因子、铜蓝蛋白；2.肝细胞内酶
4、:ALT、AST 3肝脏阻塞性疾病酶活性改变：ALP、GGT4肝硬化疾病酶活性改变：单胺氧化酶（MAO）,（四）血浆蛋白异常,第二节 肝功能试验,血清（浆）蛋白测定血清酶测定血清胆红素测定血清胆汁酸测定血氨测定,血清酶测定,（一）氨基转移酶测定,1赖氏法测定ALT,（）原理：ALT催化丙氨酸(alamine)与-酮戊二酸(-oxoglutarate)之间的氨基转移反应，生成丙酮酸(pyruvate)和谷氨酸(glutamate)。在37及pH7.4条件下反应30min，以2，4-二硝基苯肼终止反应，并与底物-酮戊二酸和产物-丙酮酸的羰基生成2，4-二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下生成红棕色，与50
5、5nm波长处读取吸光度后计算活性。,（）方法评价：赖氏法的实验结果需与卡门分光法的结果对比后求出；NaOH的浓度对显色有影响；该法的重复性差。,【参考范围】525卡门氏单位,【临床意义】,(2)慢性活动性肝炎或脂肪肝：,(1)肝细胞损伤的灵敏指标:,ALT轻度增高(100200IU),或属正常范围,2.连续监测法测定ALT,（）原理：采用酶偶联反应,即L-丙氨酸和-酮戊二酸在ALT作用下，生成丙酮酸和L-谷氨酸。丙酮酸再在LD作用下生成L-乳酸，同时NADH被氧化为NAD+,可在340nm处连续监测到NADH的消耗量,从而计算出ALT活性浓度。双试剂法:首先使血清与缺少-酮戊二酸的底物溶液混合
6、，37保温5分钟，将标本中所含的-酮酸(如丙酮酸)消耗完，然后，加入-酮戊二酸启动ALT催化的反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-A/min)，来计算ALT的活性。,（）方法评价：存在着两个副反应，会使测定结果偏高；A、血清中存在的-酮酸(如丙酮酸)能消耗NADH。B、血清中谷氨酸脱氢酶(GLDH)增高时，在有氨存在条件下，亦能消耗NADH。双试剂法，因温育期长，能有效地消除干扰反应，测定准确性高，是ALT测定的首选方法；血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性；避免使用溶血标本。,3.赖氏法测定AST,（）原理：血清中的AST可催化门冬氨酸(aspar
7、tate)与-酮戊二酸间的氨基移换，生成草酸乙酸(oxaloacetate)和L-谷氨酸。草酸乙酸自行脱羧转变成为丙酮酸。反应60分钟后，加入2，4-二硝基苯肼终止反应，并与酮酸生反应生成两种2，4-二硝基苯腙。在碱性条件下,两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在505nm处差异最大，由草酸乙酸转变成的丙酮酸所生成的苯腙呈色强度显著大于-酮戊二酸苯腙。据此可用比色法测定AST活性。,（）方法评价：赖氏法的实验结果需与卡门分光法的结果对比后求出；该法的重复性差：负干扰现象,【参考范围】828卡门氏单位,【临床意义】,肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎：血清AST也可轻度增高。,心肌梗死：血清中AST活性增高,各
8、种肝病病人：血清AST的升高,4连续监测法测定AST,（）原理：采用酶偶联反应,即L-门冬氨酸和-酮戊二酸在AST作用下，生成草酰乙酸和L-谷氨酸。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶作用下生成L-苹果酸，同时伴有NADH转化为NAD+，在340nm监测NADH的转化速率，从而计算出AST的活性。,双试剂法:同测定。,（）方法评价,误差可来自内源性和(或)外源性内源性干扰主要来自血清中高浓度丙酮酸和L-谷氨酸脱氢酶(GLDH)。外源性干扰来自试剂中污染的GLDH和AST。,【参考范围】540 IU/L(连续监测法测定),【临床意义】见赖氏法,(二)ALP测定,化学法,连续监测法：,鲍氏法,金氏法,皮氏法,、
9、金氏法测定ALP,（）原理：ALP在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解释放出酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，根据红色深浅确定ALP的活力。,(2)方法评价：,磷酸苯二钠比色法与更早的-甘油磷酸钠法相比具有较大的优点，如水解速度快，保温时间较短、灵敏度较高、显色稳定、不需去蛋白、操作简单、快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低；操作比较繁琐,，灵敏度低。,【参考范围】成人：313 单位，儿童：528单位,ALP金氏单位定义是100ml血清，37与底物保温15分钟，产生1mg酚为1个金氏单位。,ALP主要用于诊断肝胆和骨骼疾病,【
10、临床意义】,2.连续监测法测定ALP,（）原理：,以磷酸对硝基酚(p-nitrophenyl phosphate,4-NPP)为底物，2-氨基-2-甲基-1,3-丙醇（2-amino-2-methyl-1-propanol,AMP）或二乙醇胺为磷酸基的受体。在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，对硝基酚(p-nitrophenol，4-NP)在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。,（）方法评价：,线性范围可达500U/L，批内CV为2.06%2.36%，批间CV为2.74%。,【参考范围】男性：112岁 15岁 40 150U/L，25
11、岁 40150U/L。,【临床意义】见金氏法,(三)GGT测定法 化学法（重氮反应比色法）和连续监测法。,1.重氮反应比色法测定GGT,原理：,【参考范围】男性 3 17 U/L；女性 2 13 U/L,2.连续监测法测定GGT,(1)原理：,(2)方法评价：,(2)方法评价：,重氮比色法活性单位：100ml血清在37下反应1hr,生成0.5mol的-苯胺为1个GGT活性单位。,男性：1150 U/L；(以-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺为底物)女性：732 U/L 男性：40U/L；女性：30U/L(以-谷氨酰-4-硝基苯胺为底物),【参考范围】,(四)MAO测定,原理:,MAO主要作用于C
12、H2-NH2基团，在氧参与下，氧化脱氨生成相应的卞醛、氨及过氧化氢。以苄氨偶氮-萘酚为底物,在O2和H20参与下，MAO催化生成苄醛偶氮-萘酚、氨及过氧化氢，用环己烷抽提后进行比色测定。,(2)方法评价：,【单位定义】：,1ml血清与底物在37孵育60分钟，催化单胺氧化产生1nmol苄醛偶氮-萘酚为1 个MAO单位。,【参考范围】1240 U/ml(1210340103 U/L)。,【临床意义】：肝硬化时，肝纤维化现象十分活跃，MAO活性明显升高。,血清胆红素测定,重氮盐法,胆红素氧化酶(bilirubin oxidase,BOD)法,高效液相色谱法(high performance liqu
13、id chromatography,HPLC)、,导数分光光度法,直接分光光度计法,测定方法,1重氮盐改良J-G(Jendrassik and Grof method,J-G)法,(1)原理:,血清中结合胆红素与重氮盐反应生成偶氮胆红素；同样条件下，游离胆红素需要在加速剂作用下，使游离胆红素分子内的次级键断裂，极性上升并与重氮试剂反应。反应完成后加入终止试剂，继而加入碱性酒石酸钾钠使紫色偶氮试剂转变为蓝色，波长600nm下比色分析，求出血样中总胆红素的含量。,(2)方法评价：,推荐的常规方法，其方法的线性范围较宽，在 342mol/L(200mg/L)浓度下有较好的准确性和精确性，高浓度时准确
14、性和精确性降低。因此，建议浓度过高时减少血样用量测定。,【临床意义】,【参考范围】,黄疸的鉴别诊断,总胆红素:5.119.0mol/L(0.31.1mg/dL)直接胆红素:1.716.8mol/L(0.10.4mg/dL),2胆红素BOD测定法,(1)原理:,BOD在不同pH条件下催化不同组份的胆红素氧化生成胆绿素，胆绿素与氧进行非酶促反应转变为淡紫色化合物，胆红素的最大吸收峰在450nm 附近。随着胆红素被氧化,450nm下降，下降程度与胆红素浓度成正比。；在pH8.0条件下,未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，用于测定总胆红素,在pH=4.5的酸性条件下，BOD仅能催化结合胆红素和大部分胆红
15、素，而游离胆红素不被氧化，测定其含量代表结合胆红素。,(2)方法评价：,BOD法测定总胆红素的准确性、精密度比改良J-G法好,【参考范围】,血清总胆红素：10.264.10mol/L 血清结合胆红素：2.572.56 mol/L 胆红素mol/L=胆红素mg/L X 17.1,【临床意义】,见重氮比色法,四、血清胆汁酸测定,高效液相色谱法,放射免疫分析法,酶免疫分析法,比色分析测定法,测定方法,(1)酶比色法测定原理,3-HSD,胆汁酸+NAD+3-氧-5类固醇+NADH（1）,NADH+NBT 甲jie（蓝色化合物=540nm）（2）,3-氧-5类固醇+NAD+3-氧-5类固醇+NADH（3
16、）,黄递酶,4-DH,酶比色法,由于胆汁酸在血中含量低，方法检测的灵敏度达不到要求，通过增加3-氧-5-类固醇脱氢酶(4-DH)，胆汁酸经3-HSD催化的产物3-氧代胆酸在4-DH作用下再次脱氢，加大了NADH的生成量，提高了反应的检测能力（见反应式1、2、3）。但以上两种方法都存在一个缺点：生成的蓝色产物是一种染料，易于附着管壁，难于清洗或堵塞管道。,酶循环法测定原理为：,NAD+,Thio-NAD,Thio-NADH,胆汁酸,3-氧代胆汁酸,NADH,3-HSD,(2)酶比色测定法评价：,快速、简便、准确、可靠和适用的优点。它即可以手工操作、也可以在自动化仪器上进行。但试剂价贵、不易保持。
17、对酶量的要求严格，以保证酶促反应在零级反应下进行，酶量不足易产生误差。此外，标准品的制备非常重要。常采用甘氨胆酸溶入小牛血清中制成冻干品。,【参考范围】1 7 mol/L(成人空腹血清总胆汁酸),【临床意义】任何引起肝细胞损伤的病理过程都可能引起血中胆汁酸升高可见于各种类型的肝病、肝硬化、脂肪肝，也见于急慢性胆道阻塞。其中空腹胆汁酸测定是一种敏感、特异性强并相对简单的肝功能试验，是目前公认最敏感的肝功能试验之一。特别适用于可疑有肝病但其它生化试验正常或轻度异常的病人诊断。,血氨测定,为一步法，也叫直接测定即不需从全血中分离出氨即可直接测定,两步法，即先从全血中分离出氨,而后再进行测定；,微量扩散法、离子交换法,酶法和氨电极法,原理：血浆中的氨在足量-酮戊二酸和NADPH存在时，经谷氨酸脱氢酶作用生成谷氨酸,并消耗NADPH，NADPH的下降速率与血浆氨浓度成正比。,NH3-酮戊二酸NADPH 谷氨酸NADP+H2O,谷氨酸脱氢酶速率法：,谷氨酸脱氢酶,(2)方法评价：,本法特异性强、分析时间短，是较为理想的氨分析方法。在200mol/L范围内、线性良好。精密度：批内CV=3.9%；批间CV=4.5%。回收率为97.9%102.7%。,【参考范围】,血氨测定在诊断治疗肝性脑病中占有重要作用。,【临床意义】,1872mol/L(酶法),
