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1、饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响摘 要：以植物乳杆菌和大肠杆菌 E.colik88 为指示菌株，研究了饲料的液态转固态发酵与固态发酵两种工艺在 20 与 30 两种温度下的 pH 值变化及菌数的动态变化。结果表明：30 温度下，物料的酸度变化（pH 值）比 20 温度时下降的速度快、幅度大；在固态发酵过程中，液态转固态发酵的起始 pH 值低于固态发酵（P0.05），但液态转固态发酵和固态发酵在发酵过程中 pH 值差异不显著(P0.05)；在 30 的发酵温度下，乳酸细菌数呈先增值后下降趋势，但液态转固态发酵与固态发酵之间差异不显著(P0.05)；在液态转固态发酵工艺下，大肠杆菌
2、 E.colik88 菌数呈直线下降趋势，而在固态发酵工艺下，大肠杆菌 E.colik88 菌数呈先升后降，证实液态转固态工艺对原料中大肠杆菌直接产生抑菌作用。关键词：益生菌；发酵工艺；乳酸菌数；抑菌特性随着饲料中抗生素类生长促进剂在欧盟的全面禁用，饲料微生物发酵技术在动物生产中受到高度重视，欧盟已实现广泛应用。饲喂微生物发酵饲料有提高动物生长性能和改善肠道健康的作用（Scholten 等，1999；Canibe 等 2007），荷兰至少有 50的猪在饲喂发酵饲料，丹麦有 30以上的母猪饲喂发酵饲料，母猪泌乳期的使用更达 70%以上。另外，法国、瑞典、西班牙也陆续开始使用微生物发酵饲料。饲料发
3、酵目前主要采用液态发酵和固态发酵两种工艺，液态发酵（Submerged Fermentation,SmF）具有周期短、易控制、微生物的繁殖重复性强等优点，但需要配套昂贵的系统设备，难以被大众所接受；固态发酵（Solid StateFermentation,SSF）具有培养基简单，基料来源广泛；投资少，能耗低，操作方便等优点，但劳动强度大，难以与现实规模化养殖生产所需的系列化日粮配合加工结合。为此，本课题设计饲料液态发酵转固态发酵新工艺并展开了系列研究。试验以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） 和致病性大肠杆菌 E.colik88 为指示菌株，研究在液态转固态发酵饲料中
4、目标益生菌和指示菌的动态变化情况，为建立适合我国养殖生产条件的生物发酵饲料新工艺提供科学依据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌株来源植物乳杆菌由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定并保存；大肠杆菌 E.colik88 购于中国兽医药品监察所。1.1.2 培养基选择及菌株培养参照何涛等介绍的方法，植物乳杆菌采用 MRS培养基，大肠杆菌 E.colik88 采用伊红美兰培养基培养。1.1.3 主要仪器设备超净工作台（苏州安泰 SW-CJ-1CU 型）、酸度计(上海理达 PHS-25C 型)、高压蒸汽灭菌锅（上海申安ZDX-35BI 型）、恒温培养箱 （黄石恒丰 SP-01 型）、微
5、型发酵瓶(罐头瓶)。1.1.4 发酵基料设计原则以生长后期仔猪配合饲料为发酵的基础原料，即不含预混料的配合饲料（配方见表 1）。在此基础上，制备如下三种发酵基料，固态发酵基料：为不含微量元素、维生素、矿物质的配合饲料；液态发酵基料：玉米、豆粕按质量分数 1： 3 混合均匀；液态转固态发酵基料：为固态发酵基料中减去液态发酵基料的部分。饲料工业2011 年第 32 卷第 5 期试 验 研 究30表 1 固态发酵基料配方原料名称玉米豆粕鱼粉麸皮膨化大豆比例（%）66183581.2 试验方法1.2.1 试验设计与方案采用 2 因子试验设计。研究了2 种发酵温度（20 ，T1；30 ，T2）下，不同发
6、酵工艺（液态转固态发酵和固态发酵）对 pH 值及菌落数的影响，设计方案见表 2。表 2 设计方案发酵温度T1（20）T2（30）发酵工艺液态转固态发酵固态发酵液态转固态发酵固态发酵1.2.2 试验操作方法1.2.2.1 液态转固态发酵工艺操作方法第一阶段（液态发酵）：称取 20 g 液态发酵基料于微型发酵瓶中，以料水比 1： 3.5 加入 70 g 水，按106cfu/g 物料接入植物乳杆菌，在 25 的恒温条件下静置培养 48 h。第二阶段（固态发酵）：直接在液态发酵料中加入80 g 的固态配合料，搅拌均匀，使终水分在 40%左右。并按每 106cfu/g 物料接种 E.colik88，密封
7、置恒温培养箱中培养。1.2.2.2 固态发酵工艺操作方法与液态转固态发酵工艺的第二个阶段同时进行，具体操作如下：称取 20 g 液态发酵基料和 80 g 的固态配合料于微型发酵瓶中，加入一定质量的水，使终水分在 40%左右，按 106cfu/g 物料分别接种植物乳杆菌和 E.colik88，搅拌均匀，密封置恒温培养箱中培养。1.2.3 指标测定分别于固态发酵开始后第 0、24、48、72、120、168 h无菌取样，进行 pH 值和微生物的测定。pH 值测定：取鲜样 10 g，用 100 ml 蒸馏水浸提 12 min 后，经纱布过滤，水浸液当即用酸度计测定 pH值。微生物测定采用 10 倍稀
8、释法，植物乳杆菌测定应用 MRS 琼脂培养基，37 培养 36 h，大肠杆菌 E.colik88 测定采用 EMB 培养平板，37 培养 24 h。1.3 数据处理微生物及 pH 值数据采用 SAS6.12 的 t-test 过程进行两组均数的差异显著性检验。2 结果与分析2.1 发酵过程中 pH 值的动态变化2.1.1 不同发酵工艺对 pH 值的影响（见表 3）在发酵过程中，液态转固态发酵起始（0 h）pH 值明显优于固态发酵，差异显著（P0.05）。在随后的发酵时间里，2 个发酵温度下，液态转固态发酵和固态发酵 pH 值差异都不显著(P0.05)。这主要是因为液态转固态发酵工艺中接种的益生
9、菌株植物乳杆菌发酵过程中产生的乳酸、乙酸等有机酸成分，在液态转固态发酵时直接降低了饲料的 pH 值。因而随着发酵时间的延长，pH 值趋向一致，所以差异不显著。2.1.2 不同发酵温度对 pH 值的影响（见图 1）76543210pH值0 2448 72 120168液态转固态发酵 T1液态转固态发酵 T2固态发酵 T1固态发酵 T2时间（h）图 1 不同发酵温度对 pH 值的影响1684.050.05a3.960.04a3.940.03a4.010.02a表 3 不同发酵处理对 pH 值的影响05.820.02a6.400.03b5.820.02a6.400.03b244.540.10a4.4
10、90.01a4.220.04a4.190.01a484.280.06a4.290.05a3.970.03a3.960.05a724.150.02a4.150.02a3.860.01a3.870.02a1203.950.01a3.940.06a3.900.04a3.860.04aT1液态转固态发酵固态发酵T2液态转固态发酵固态发酵项目培养时间（h）注：同一温度下同列标注字母不同者差异显著（P0.05）。 下表同。杨雪海等：饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响试 验 研 究31从图 1 可见，液态转固态发酵和固态发酵在 T1、T2 两个发酵温度下随发酵时间的延续均表现出逐渐下降的趋势，
11、在 120 h 时降到最低，随后出现轻微的上升。在 24、48、72 h 三个时间点两种发酵工艺的pH 值T2 明显低于 T1（P0.05），在随后的时间未表现出明显的差异(P0.05)。2.2 发酵过程中植物乳杆菌菌数变化2.2.1 不同发酵工艺对植物乳杆菌菌数的影响（见表 4）从表 4 可知，发酵温度为 20 （T1）时，48 h 以前2 种发酵工艺的植物乳杆菌菌数差异显著 （P0.05），72 h 以后的各点差异不显著；而发酵温度为 30 （T2）时，24 h 以前 2 种发酵工艺的植物乳杆菌菌数差异显著（P0.05），24 h 以后的各点差异不显著。2.2.2 不同发酵温度对植物乳杆菌
12、菌数的影响（见图 2）121086420菌数(logcfu/g)0 2448 72 120168液态转固态发酵 T1液态转固态发酵 T2固态发酵 T1固态发酵 T2时间（h）图 2 不同发酵温度对植物乳杆菌菌数的影响从图 2 可知，在 72 h 以内，液态转固态发酵和固态发酵植物乳杆菌数菌数在 T1、T2 发酵温度下未表现明显差异(P0.05)。但在随后的发酵时间里，表现出显著的差异（P0.05）。T1 发酵温度下的植物乳杆菌菌数优于 T2 发酵温度。2.3 发酵过程中 E.colik88 的菌数变化2.3.1 不同发酵工艺对 E.colik88 菌数的影响（见表 5）由表 5 可见，在 T1
13、 发酵温度下，液态转固态发酵工艺和固态发酵工艺大肠杆菌 E.colik88 菌数表现出较大的差异。液态转固态发酵大肠杆菌 E.colik88 呈直线下降趋势，在 72 h 降到检测限以下，固态发酵则表现为先上升后下降趋势，固态发酵在 120 h 才降为检测限以下。在 T2 发酵温度下，2 种发酵工艺大肠杆菌 E.colik88 菌数在发酵 24 h 时差异显著（P0.05)，随后均降为检测限以下。2.3.2 不同发酵温度对 E.colik88 菌数的影响（见图3）从图 3 可见，液态转固态发酵大肠杆菌 E.colik88 的菌数在 T1、T2 发酵温度下，呈直线下降趋势，在 T1 温度下 72
14、 h 降到检测限以下，而在 T2 温度下48 h 就降到了检测限以下。固态发酵 E.colik88 菌数则表现为先上升后下降，在 T1 温度下，48 h 达到最高值，随后出现下降，120 h 降到检测限以下，在 T2 温度1689.590.17a9.540.20a8.910.12a8.930.09a表 4 不同发酵处理对植物乳杆菌菌数的影响（logcfu/g）08.200.20a6.150.15b8.200.20a6.150.15b249.530.10a9.410.11b9.630.23a9.490.14b489.620.08a9.470.09b9.590.09a9.570.21a729.63
15、0.23a9.540.14a9.600.18a9.530.05a1209.560.14a9.560.17a8.860.08a8.930.13aT1固态发酵液态转固态发酵T2固态发酵液态转固态发酵项目培养时间（h）1683.00.003.00.003.00.003.00.00表 5 不同发酵工艺对 E.colik88 菌数的影响（logcfu/g）06.000.12a6.000.12a6.000.12a6.000.12a245.960.15a7.000.05b4.400.20a6.850.15b485.100.08a8.300.15b3.00.003.00.00723.00.005.450.08
16、a3.00.003.00.001203.00.003.00.003.00.003.00.00T1液态转固态发酵固态发酵T2液态转固态发酵固态发酵项目培养时间（h）注：“”表示当微生物的数目低于检测限时，该微生物数目用检测限表示。 大肠杆菌的检测限为 3.0 logcfu/g。 数据以“平均值标准差”的形式表示。杨雪海等：饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响试 验 研 究32下，24 h 升到最高值，随后降为检测限以下。0 2448 72 1201689876543210E.colik88菌数(logcfu/g)液态转固态发酵 T1液态转固态发酵 T2固态发酵 T1固态发酵 T2时间
17、（h）图3 不同发酵温度对 E.colik88 菌数的影响3 讨论有些发酵饲料的加工并不是人为接种微生物，这种发酵叫做自然发酵。目前国外大多数液态发酵饲料采用这种发酵方式。但是自然发酵的方向不容易控制，结果可预见性比较差。微生物接种发酵做为一种新型的发酵方式，在优化的发酵条件下，可以产生预见性更强的发酵结果。因此本试验比较了在不同的发酵温度下，微生物接种后进行液态转固态发酵和固态发酵两种不同的发酵工艺对发酵过程中的 pH 值、乳酸菌菌数及 E.colik88 菌数的影响。3.1 酸化日粮能改善动物消化机能研究表明，只有动物消化道 pH 值稳定在适合的范围内，才能维持正常的消化生理，pH 值过高
18、能显著地抑制胃蛋白原的活化，当 pH 值高于 6 时，胃蛋白就会失活。发酵饲料较低的 pH 值满足动物的这种需要。试验中液态转固态发酵和固态发酵均能在 24 h 内使pH 值降到 4.5 以下，随着发酵温度的升高降低的幅度更大，并且相同时间内 30 的发酵温度 pH 值要低于20 的。在固态发酵过程中，液态转固态发酵起始 pH值优于直接固态发酵（P0.05），主要是因为在液态转固态发酵工艺中，液态发酵产生的乳酸、乙酸等短链脂肪酸在转固态发酵时具有明显的酸化日粮的作用。3.2 发酵影响乳酸菌数乳酸菌由于其具有降低消化道内 pH 值、抑制其它病原性微生物生长、保持或恢复肠道内微生物群落的平衡、防病
19、促生长等作用，现已被广泛应用于食品加工、医药保健、饲料发酵及畜禽疾病防治等方面。有资料报道，益生菌发挥功能的最低剂量为 6 logcfu/g，因此，其数量就成为各种产品追求的主要指标。本次试验中，液态转固态发酵和固态发酵乳酸菌数均达到了9.5 logcfu/g 左右，这与 Van Winsen(2002)、Demeckova(2006)等所报道的乳酸细菌数 9.4 logcfu/g 相一致。在固态发酵的初始阶段，液态转固态发酵工艺乳酸菌数优于直接固态发酵（P0.05），随后无明显差异 (P0.05)。这是因为在液态转固态发酵工艺中液态发酵过程使乳酸菌得到大量的增值，所以在转固时较直接固态发酵乳
20、酸菌数占明显优势，随着发酵的过程进行乳酸细菌数趋向一致。3.3 发酵过程中不同菌增殖特点饲料和水接触后，发酵即开始。在发酵的起始阶段，发酵饲料以低的乳酸菌含量、高的 pH 值和大肠杆菌的增值为特点。随后发酵将进入一个稳定阶段，以高的乳酸菌和低的大肠杆菌含量为特点。试验中固态发酵大肠杆菌 E.colik88 出现先增殖后下降的趋势，这与 Jensen（1998）、Canibe（2003）报道的相一致。而液态转固态发酵指示菌株 E.colik88 成直线下降趋势，对 E.colik88 有明显的抑制作用。这可能是在液态发酵过程中，接种的植物乳杆菌发酵代谢产生的乳酸、乙酸、双乙酰以及一些细菌素类物质
21、在转固发酵过程中直接起到了抑制和杀菌作用。Winsen 等的研究发现，使用胚芽乳杆菌(Lplantarum)发酵猪饲料的前 2 h 内具有抑菌作用，再往后就表现出杀菌效果。3.4 发酵温度是影响发酵效果的重要因素在最适温度范围内，随着温度的升高，菌体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。当超过最适温度范围以后，随着温度的升高，菌体衰老加快，发酵周期缩短。试验中选择了 20 和 30 两个不同的发酵温度，从饲料的 pH 值变化和乳酸菌数来看，30 的发酵温度下饲料 pH 值比 20 的降低幅度大，乳酸菌数的衰老情况也较严重，在检测时间内，出现明显的先升高后下降的趋势，但并未发现两种发酵工艺间存在显
22、著差异。从对 E.colik88 的抑制效果来看，30 的发酵温度要优于 20 的，主要是因为温度的升高，菌体衰老加快，再加上乳酸细菌对其的抑制，双重作用使得其在短时间内就降为检测限以下。因此在生产中，可根据实际需要选择合适的发酵温度。4 小结液态转固态生产发酵饲料的工艺，综合了液态发酵和固态发酵的优点，使物料的起始 pH 值降低，加之液态发酵产物的综合作用，改变了饲料原料中致病性大肠杆菌等杂菌的生存环境，使其失去增殖条件，呈现对原料杂菌的明显抑杀作用。这对提高益生菌发酵饲料的生物安全性具有重要意义。（参考文献 12 篇，刊略，需者可函索）（编辑：刘敏跃，lm- y）杨雪海等：饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响试 验 研 究33
