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1、蛋白质构效关系和新型溶栓药物的设计与研制,分子医学教育部重点实验室宋后燕2005-6-15,蛋白质分子构效关系的研究,遗传信息传递的中心法则基因 转 录 反转录信息 RNA蛋白质(表型)遗传信息决定蛋白质分子的结构和功能,复制,翻译,蛋白质分子结构的研究,一级结构高级结构 X 射线晶体衍射分析多维核磁共振计算机模拟,蛋白质分子结构计算机模拟,1.蛋白质分子结构的模型化：蛋白质分子结构的计算机化2.蛋白质分子结构的几何优化3.蛋白质分子结构构象分析4.蛋白质分子结构搜索5.蛋白质分子结构间相互作用(Molecular Docking)范德华作用静电作用 弱非键相互作用疏水作用,计算机描述分子结构
2、的表达方式,碎片码线性码拓朴码,蛋白质结构转换为计算机语言 计算机作结构分析和处理(最简单、唯一的方式进行表达),拓扑码,利用图论知识分子结构 数学图原子(CHON)：结点 不同原子用不同颜色表结点化学键：图中的边(单键、双键、芳香键等不同键用不同颜色),蛋白质分子结构模拟,蛋白质分子结构的查询：如搜索分子力学计算分子动力学计算量子化学计算,编码方式不足以表达蛋白质分子空间结构,连接表：分子中所有原子、键及其空间关系 提供信息,原子信息：类型电荷坐标键信息：类型所连原子糖链金属离子 其他特殊结构信息,计算机工作站 软件 连接表(PDB数据库)(蛋白质分子三维结构图),蛋白质分子模拟时常用算法,
3、1、分子力学方法(Molecular Mechanics，MM)计算分子几何构型和能量原子设为大小不同橡皮球键设为长度弹簧,蛋白质分子成为间谐振动力学模型 Hook 定律计算原子势能,能量函数计算：一系列能量项的加和,EtotEstrEbendEtorsEvdwEelecEtot 分子总能量 Etors 两面角扭转能量Estr 键伸缩能量 Evdw 范德华能量Ebend 键角扭转能量 Eelec 静电能量,2、分子动力学方法(Molecular Dynamics,MD),以分子力学为基础设定势能函数和力场按经典牛顿力学运动方程积分搜索蛋白质分子系统的运动和构型空间(基本设定：无限空间的平均系统
4、整体的平均或构型空间的积分)常用积分算法：Verlet 积分 Becman 算法Leap-Forq 算法,分子动力学方法用于：,模拟多肽、蛋白质或低聚糖、寡糖的分子空间构型计算晶体(固相)或溶液中(液相)蛋白质分子空间构型,分子动力学用于构象搜索时：,用势能函数的梯度iF 表示 Fi随机产生初速度以原子的初始坐标为起点计算 t 时刻时原子位置运动速度新构象,给定时间内多次迭代分子的优势构象,力场和势函数,必须对每个待模建分子赋予一定力场。分子能量和分子结构之间关系就是分子力场函数(势函数)。分子的能量看作分子内各原子的空间坐标的函数，即分子的能量随分子构型的变化而变化。分子力场函数由经验公式计
5、算。,3、量子力学方法(Quantum Mechanic，QM),设定下列 3 个近似，计算分子轨道3.1.非相对论的量子力学(薛定谔方程)3.2.玻尔奥本海默近似，将核运动和电子运动分开考虑 3.3.轨道近似 原子轨道组合后表示分子轨道蛋白质分子中特殊结构(金属元素、糖、脂等)没有合适力场参数选用量子力学计算法进行优化 反应过渡态极化状态特殊电子云量子力学方法计算量和代价很大,分子力场函数构成：,1、键伸缩能(bond)2、键角弯曲能(bond angle)3、两面角扭曲能(dihedral angel)4、非键相互作用(nonbonded interaction)5、交叉能量项,分子能量和
6、构型函数：,1、各种不同原子在不同成键状况下的物理参数，键长、键角和两面角等。2、这些参数来自实验或量子化学计算。,蛋白质分子间相互作用：,1、成键作用2、非成键作用,表：蛋白质之间的4种非键相互作用(水溶液中),非键作用：力场方法计算成键作用：量子化学计算,蛋白质分子对接模建：,低精密度构象搜索对搜索到的构象，用能量函数打分、分离、筛选对高分构象作结构优化、能量评价判定分子对接模拟图,蛋白分子对接：,1、实时图形对接2、自动对接,实时图形对接：,1、以对接的蛋白质分子晶体结构为基础2、计算结合部位各种表面性质(静电、氢键、疏水键分布)3、计算对接表面性质4、按互补匹配原则，对接到结合部位计算
7、机工作站分子模拟软件,分子对接容易模拟,自动对接：,1、蛋白质表面结构计算和模拟(MS法)2、两分子蛋白质分子表面结构匹配(口袋、凹槽)3、匹配取向和优化参考,实施例：,1、葡激酶分子单体三维结构模拟2、2 分子葡激酶分子与微小纤溶酶对接,蛋白质构效关系研究中运用的理论和技术基础,计算机分子结构和分子对接模拟晶体结构分析(固相结构)核磁共振(液相结构)分子动力学计算：生物传感器LC/MS、噬菌体展示,t-PA 和 新型 t-PA,组织纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA),人体内专一水解纤溶酶原形成纤溶酶，激活纤溶系统。纤溶功能在清除血管
8、内纤维蛋白，保持血液循环起重要作用。,The role of t-PA in fibrinolysis,t-PA 分子结构,t-PA 的指形区(F区),t-PA 分子 1-50 位氨基酸与纤维结合蛋白分子的指形区结构同源性很高t-PA 分子与纤维蛋白的作用不仅和 F 有关，和其他结构域也有相互作用部分水解 t-PA 分子的 N 端，破坏指形区，导致 t-PA 分子失去与纤维蛋白的结合能力编码指形区基因的表达产物也能竞争性的抑制 t-PA 与纤维蛋白的结合缺失指形区的 t-PA(t-PA F)，仍具有与纤维蛋白亲和力，而且 t-PA F 激活纤溶酶原的速率仍受纤维蛋白加速,t-PA 分子结构,t
9、-PA 的表皮生长因子区(E区),t-PA 分子的 5191 位氨基酸与人表皮生长因子的同源性很高E 区存在肝细胞膜受体识别的结构与肝细胞膜受体结合，从血液中消除 t-PA缺失 E 区的 t-PA，血液内半衰期延长,t-PA 分子结构,t-PA 的三角区,K1 和 K2个三角区()，氨基酸残基 92173，180261 组成。Kl 和 K2 都与纤溶酶原分子、凝血酶原分子的三角区有同源性。K2 区是 t-PA 分子与纤维蛋白分子结合部位，比 F 更为重要。K2 特异的单抗与 t-PA 结合后，t-PA 失去了与纤维蛋白结合的能力；含完整的 K2 的 t-PA 酶解片段，对纤维蛋白的亲和力。,t
10、-PA 分子结构,t-PA 的轻链,由 276-527 位氨基酸组成，与胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶有很高的同源性含有 t-PA 的活性中心，即 His322、Asp371、Ser478轻链具有激活纤溶酶原的活力轻链特异的单抗特异地与 t-PA 的轻链结合，并抑制其活性轻链 cDNA 表达产物，也有 t-PA 活性，t-PA 水解纤溶酶原由轻链决定t-PA 的活性受 PAI 抑制用 DFP 处理后的 t-PA 分子不能再和 PAI 结合 PAI 和 t-PA 的结合位点：K296-R299,t-PA 作为基因工程溶栓药物的优缺点,优点：非异源蛋白 高效溶栓 特异性催化血栓中纤溶酶原，溶解血栓中纤维蛋
11、白缺点：t1/2短 4-6min 剂量大 50-100mg 血管再栓塞(5-25%)价格昂贵,t-PA 分子结构改造的策略,降低 t-PA 的血浆清除速率；增强纤维蛋白特异性；降低血浆抑制剂 PAI 对 t-PA 的抑制作用；增加 t-PA 分子稳定性,实现 t-PA 改造的方法,定点突变缺失突变融合蛋白,1.Reteplase,t-PA 缺失突变的产物缺失突变指形区，生长因子样区和 K1 三角区含野生型 t-PA K2 三角区，轻链结构域15060例随机比较 r-PA 与 rt-PA 溶栓治疗 AMI(1997)30天内死亡率 30天内脑卒中 大出血 颅内出血R-PA 7.43%1.67%0
12、.72%0.91%rt-PA 7.22%1.83%0.82%0.88%NS NS NS NS(1)血浆半衰期延长 2-20 倍，溶栓效率提高 3-5 倍。(2)r-PA 用大肠杆菌表达，廉价，试用方便，易于推广，产品已经上市，竞争力强。(3)不良反应与 rt-PA 比较无统计学上差别。,Primary Structure of r-PA,2.TNK-tPA,野生型 t-PA 点突变产物(1)K1结构域替换一个氨基酸，形成一个新的糖基化位点。(2)K1结构域替换一个氨基酸，去除一个原有的糖基化位点。(3)轻链结构域中替换四个氨基酸。逃逸PAI-I的抑制作用。TNK-tPA rt-PA 血浆t1/
13、2(min)17 3-4 纤维蛋白特异性 体外溶栓速度 体内溶栓速度 PAI-1抗性 再梗塞,Primary Structure of TNK-tPA,TNK-tPA 的不良反应,死亡率(%)非颅内大出血(%)颅内出血(%)TNK-tPA 6.2 4.7 0.9(n=8641)rt-PA 6.2 5.9 0.9(n=8488),3.Lanoteplase(NPA),野生型t-PA缺失突变体，去除了指形区，表皮生长因子区，并修饰了 K1 三角区内的糖基化位点。由中国仓鼠卵巢细胞表达生产。NPA rt-PA 半衰期 t1/2(min)37 3-4 冠脉再通率()57 46 出血等不良反应 NPA可
14、一次性静脉用药,4.AFA-UK 导向溶栓药物,纤维蛋白单抗 Fab 片段 单链 UK(快速与血栓结合)(溶栓作用)血浆 t1/2 显著延长，溶栓效率比 rt-PA 和 Scu-PA 提高 9 倍。血浆t1/2(min)凝血时间 AFA-UK 61.3 正常 Scu-PA 5.0 延长 rt-PA 4.3 延长,导向溶栓药物,针对不同的需要可以选择不同的单抗选用抗纤维蛋白单克隆抗体选用抗血小板膜受体 GP IIb/IIIa、GMP-140 等的单克隆抗体针对富含凝血酶的新鲜血栓，则可选用抗凝血酶单抗作为导向载体,葡激酶和新型葡激酶,Crystal of r-Sak,Crystal Struct
15、ure of r-Sak,3D Modeling Structure of mPlg,Molecular Docking of Sak and mPlg,Dimer Structure of r-Sak,Reducing SDS-PAGE(A)and zymography(B)analysis of stored wt-Sak,Hydrophobic Side of r-Sak,Allergic reaction of guinea pigs after immunized by Sak,Groups n%wt-Sak 20 16 4 75 RGD-Sak 20 2 18 10,Antipla
16、telet aggregation activity and lower immnogenicity of RGD-Sak,Conformation stability and plasminogen activation activity of RGD-Sak,Sak versus t-PA:similar fibrinolytic potential superior fibrin-specificity much cheaper($200:$2000)Sak versus SK:more efficiency more fibrin-specificity,Advantages of wt-Sak compared with t-PA,SK,Two functions:Antiplatelet Aggregation ThrombosysisReduced retenosisReduced Immunogenicity:more affective and safe,Adavantage of RGD-Sak compared with wt-Sak,
