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1、DNA的生物合成,遗传学的中心法则,DNA复制 亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每条单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。,复制的基本规律,（一）DNA的半保留复制1、半保留复制假说的提出：1953年，Watson&Crick在DNA双螺旋基础上提出。,Matthew Meselson and Franklin Stahl more recently,Faculty member at HarvardMechanisms of Molecular Evolution,Faculty memb
2、er at U.of OregonMeiotic Recombination,Density labeling experiment on E.coli(bacterial)DNA,Meselson and Stahl(continued),Harvest some cells“1st generation”,Harvest some cells“2nd generation”,For each generation isolate the DNA and spin through a density(CsCl)gradient).Detect DNA in the gradient(eg b
3、y UV absorption)Monitor how many DNA bands there are after each generation,原核生物：基因组是环状DNA 只有一个复制起始点 复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制,复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的结构称为复制叉(replication fork)。,在原核生物双向复制中，DNA被描述为眼睛状。为说明方便而做的图为形。,ori,真核生物：染色体DNA有多个复制起始点。两个起始点之间的DNA片段称为复制子(repl
4、icon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉,真核生物的多复制子复制电镜图,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),三、复制的半不连续性,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,冈崎片段：1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。原核生物:10002000个核苷酸 真核
5、生物:100200个核苷酸,半不连续复制动画,第二节 DNA 复制的酶学和拓扑学变化,DNA复制的体系 底物:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)聚合酶:依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)模板:解开成单链的DNA母链 引物:提供3-OH末端的寡核苷酸 其他酶和蛋白质因子:拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶,一、复制的化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5 3方向进行。,二、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polym
6、erase)简称：DNA-pol,活性：1.53 的聚合活性 2.核酸外切酶活性,原核生物DNA pol：,E.coli DNA 聚合酶:DNA pol I DNA pol II DNA pol III DNA pol IV DNA pol V,DNA pol I,Arthur Kornberg(1958),Currently a faculty member at Stanford School of Medicine,polA gene928aa,102KD单一肽链400分子/cell,多功能酶,3 to 5 exonuclease activity5 to 3 exonuclease a
7、ctivity5 to 3 DNA polymerizing activity,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,Klenow fragment 具有校对作用Proofreading function,53核酸外切酶活性,切口（缺刻）平移,nick translation,*gap fill-in,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除引物和突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解
8、。,核酸外切酶活性,功能：校读，去除RNA引物，填补空隙，参与DNA损伤修复。,DNA-pol,DNA Polymerase I is great,but.,1969年，Paula Delucia和John Cairns分离得到的E.coli突变菌株polA-，其DNA pol的活性只有正常菌株的1%，但是仍然可以正常分裂。,DNA pol I的聚合反应速度为103base/min，原核生物实际的复制速度为105base/min。DNA pol I的进行性不高,进行性 processivity是聚合酶从模板链上解离下来之前所能添加的核苷酸数。,DNA聚合酶II(DNA-pol II)具有53的
9、聚合酶活性。只是在无pol及pol的情况下暂时 起作用。对模板的特异性不高,参与DNA损伤 的应急状态修复。,DNA pol III 是E.coli 中 真正的复制酶！,DNA聚合酶III(DNA-pol III)是复制延长中真正起催化作用的酶。由10种亚基组成不对称的聚合体。，亚基组成核心酶，亚基具有53的聚合活性，亚基具有35外切酶活性，亚基可能起组装作用。,亚基(DNA夹子)能夹稳模板链，负责酶沿DNA模板滑动的作用。其余亚基统称为-复合物,是DNA夹子加载蛋白。,DNA-pol,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,复制的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与
10、低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,三、复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读（二）复制的保真性和碱基选择,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读,（二）复制的保真性和碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,1.遵守严格的碱基
11、配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的即时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,E.Coli 基因图,解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保
12、护单链的完整性。,DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),10,8,局部解链后,拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键克服解链过程中的打结、缠绕现象,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。（主要）,作用机制,拓扑异构酶的作用,拓扑异构酶
13、的作用,解旋解链酶类的作用,引物酶(primase),依赖DNA的RNA聚合酶。可以催化游离NTP聚合。在大肠杆菌，是dna G 基因的表达产物。催化RNA引物的生成。,引物（primer）：是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3-OH末端。,五、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP（NAD+）,AMP,5,3,5,3,在复制中起接合双链中单链缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的
14、功能,DNA生物合成The Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.合成引物，提供3-OH末端;形成引发体。,一、原核生物的DNA生物合成,GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG,5,3,1.DNA解链,E.coli复制起始点 oriC,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA,串联重复序列,反向重复序列,5,3,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3
15、,5,3,5,2.引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,DNA解成单链 由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶 解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成,随从链的合成,复制过程简图,复 制 过 程 动 画,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,E.coli,ori,te
16、r,82,32,ori,ter,SV40,50,0,（三）复制的终止,随从链上不连续性片段的连接,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,二、真核生物的DNA生物合成,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。,（一）复制的起始,增殖细胞核抗原(prolife
17、ration cell nuclear antigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。酵母DNA复制起始点为11bp富含AT的核心序列。复制起始包括打开复制叉、形成引发体和合成RNA引物。,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,DNA复制与核小体装配同步进行。染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制终止包括：岡崎片段、复制子之间的连接。端粒的合成,（三）复制的终止和端粒酶,岡崎片段的连接,真核生物端粒的形成：,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,结构特点,由末端DNA序列和蛋白
18、质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。,端粒酶(telomerase),线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。,端粒酶(telomerase),端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶的分子结构,端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse
19、transcriptase,hTRT),端粒酶的组成,端粒酶的爬行模型（动画演示）,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,端粒及端粒酶的意义,成年人端粒比胚胎细胞端粒短；老化与端粒酶活性下降有关；肿瘤的发生与端粒酶活性有关；端粒酶不一定能决定端粒的长度。,抗肿瘤靶点,正常细胞：,细胞分裂,细胞分裂,衰老死亡,细胞年轻化,抗衰老,逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,逆转录(reverse transcription)在逆转录酶的催化下，以RNA为模板合成DNA的过程，又称反转录。,一、逆转录病毒和逆转录
20、酶,逆转录酶(reverse transcriptase),从RNA病毒中发现，能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶，全称为依赖RNA的DNA聚合酶。有三种活性：RNA指导的DNA聚合活性 RNase H活性 DNA指导的DNA聚合活性,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物
21、，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,滚环复制(rolling circle replication),三、滚环复制和D环复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制,滚环复制动画,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。由DNA聚合酶-g催化。两条链的复制起点的位置不同。,D环复制,H链,L链,DNA损伤（突变）与修复DNA Damage(Mutation)and Repair,第五节,突变(mutation)：是由遗
22、传物质结构改变而引起的遗传信息的改变。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。DNA损伤(DNA damage)：泛指一切DNA结构和功能的变化。包括各种突变类型、碱基的损伤和DNA链的断裂。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,自发性:自然错配率约为10-910-10 左右。物理因素:如UV(ultra violet)、各种辐射。化学因素:烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质，这些诱发突变的化学物质,称为致癌剂。生物因素:抗菌素类、黄曲霉素和病毒等。,物
23、理因素,化学因素,常见的化学诱变剂,化合物类别,作,用,点,分子改变,碱基类似物,如：,5,-,BU,A,5,-,BU,G,-,A,-,-,T,-,-,G,-,-,C,-,羟胺类（,NH,2,OH,）,T,C,-,T,-,-,A,-,-,C,-,-,G,-,亚硝酸盐（,NO,2,）,C,U,-,G,-,-,C,-,-,A,-,-,T,-,烷化剂,如：氮芥类，,Nitromins,G,m,G,G,m,G,DNA,缺失,G,三、突变的分子改变类型,错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point
24、 mutation),（一）错配,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。,（二）缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变。,缺失引起框移突变,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,四、DNA损伤的修复,修复(repairing)是对已发
25、生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(light repairing)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型,光修复酶,（一）光修复,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,UvrA,UvrB,UvrC,OH,P,DNA聚合酶,OH,P,DNA连接酶,NAD+,E.coli的切除修复机制,切除修复动画,切除修复对多种DNA损伤起修复作用：碱基脱落形成的无碱基位点 嘧啶二聚体 碱基烷基化 单链断裂 碱基错配 庞大的化学附加物 链间交联,着色性干皮病(xeroderma pigmentosis，XP)是切除修复缺陷性的遗传病。XP病人细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低，不能修复紫外线照射引起的DNA损伤，因此易发生皮肤癌。,（三）重组修复,（四）SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,
