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1、Putian University,12级临本,1,第14章,DNA的生物合成DNA Biosynthesis(Replication),Putian University,12级临本,2,复制(replication)：是指由亲代DNA为模板合成两个相同的子代DNA的过程。,DNA的生物合成的方式：,DNA自我复制,DNA修复合成,逆转录合成,Putian University,12级临本,3,DNA复制的基本特性characteristics of DNA Replication,第 一 节,Putian University,12级临本,4,半保留复制(semi-conservative
2、 replication)双向复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-discontinuous replication),DNA复制的主要特征,Putian University,12级临本,5,一、半保留复制,半保留复制：指DNA复制时，母链DNA双螺旋结构解开为两条单链，并各自作为模板，以四种dNTP为原料，按照碱基互补配对原则合成与之互补的新链。使在子代DNA双链中一条来自于亲代，另一条是新合成。这种复制方式称半保留复制。,1、半保留复制概念,3、半保留复制的意义,体现了遗传的保守性。,2、半保留复制的实验证据,Meselson和Stahl密度
3、梯度实验,Putian University,12级临本,6,Meselson和Stahl密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮N15-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,半保留复制证据,Putian University,12级临本,7,二、DNA复制的方向和方式,1、DNA复制的方向：,由5 3方向合成,以双向复制为主。,2、DNA复制的方式：,大多数原核和真核生物复制时，DNA都是从固定起始点(原核一个起点，真核多个起点)开始向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制方式，即为双向复制。,复制叉,Putian University,12级临本,8,通常把两个相邻起始
4、点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,复制子(replicon),Putian University,12级临本,9,因为催化DNA合成的DNA聚合酶只能以53方向合成子代DNA链决定模板DNA链的方向必须是35。,三、半不连续复制,半不连续复制是指DNA复制时，以35方向为 模板合成新链时是连续合成的。而以5 3 方向为模板合成新链时是不连续合成的。,Putian University,12级临本,10,领头链与随从链,领头链(leading strand)：以35方向的亲代DNA链为模板连续合成的子代链称为领头链。,随从链(lagging str
5、and)：以53方向的亲代DNA链为模板不连续合成的子代链称为随从链。随从链由不连续片段组成。不连续片段称冈崎片段(Okazaki fragment),Putian University,12级临本,11,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,The Enzymology and Topology of DNA Replication,Putian University,12级临本,12,DNA复制的反应体系组成:,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol；模板(template)
6、:解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶(解螺旋酶、拓扑异构酶、引物酶、DNA连接酶)和蛋白质因子(单链DNA结合蛋白)。,Putian University,12级临本,13,一、DNA聚合酶,聚合的功能：催化3，5磷酸二酯键的形成,核酸外切水解酶的功能,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)。简称：DNA-pol,1、聚合反应具有方向性:53,2、聚合反应具有模板依赖性,DNA聚合酶聚合反应特点,3、DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合，DNA新链生成需引物参与,Putian
7、University,12级临本,14,DNA聚合酶的5至3的聚合活性,dTTP,3,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+ppi,dTTP,Putian University,12级临本,15,35外切酶活性,53外切酶活性,能切除突变的 DNA片段,能辨认错配的碱基对，并将其水解,DNA聚合酶的核酸外切酶活性,?,Putian University,12级临本,16,(一)原核生物的DNA聚合酶,原核生物DNA聚合酶有三种：DNA-pol、DNA-pol、DNA-pol,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol（109kD）,小片段,5核酸外切
8、酶活性,大片段/Klenow 片段,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,Putian University,12级临本,17,DNA-pol（120kD）,DNA-pol 功能不详，有研究表明它可能参与DNA损伤的应急状态修复。,DNA-pol(250kD),原核生物DNApol 全酶由10种(、)22个亚基构成不对称二聚体。,DNA-pol是原核生物DNA真正的复制酶。作用 是在领头链和随从链的引物上进行DNA的延伸。,Putian University,12级临本,18,核心酶含、三亚基,亚基分别催化领头链 与随从链的合成,亚基有35 外切酶活性及对 碱基的选择功能,亚基为装配所必需,亚
9、基起着夹住模板又 能使酶延模板滑动的作 用。,DNA-pol,Putian University,12级临本,19,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,(二)真核生物的DNA聚合酶,Putian University,12级临本,20,原因：DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对的保证。,复制过程中，DNA复制的保真性至少依赖三种机制：,1、遵守严格的碱基配对规律2、聚合酶在复制
10、延长时对碱基的选择功能3、复制出错时DNA-pol的及时校读功能,二、复制的保真性(fidelity),复制的保真性是指复制产生的子代DNA的碱基序列与亲代DNA的碱基序列所保持的一致性。,Putian University,12级临本,21,1以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;2需要模板和引物的存在;3不能起始合成新的DNA链;4催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端;5催化DNA合成的方向是53。,小结：DNA聚合酶的共同性质是:,Putian University,12级临本,22,三、DNA解螺旋酶、DNA拓扑异构酶 单链DNA结合蛋白,(1）解螺旋酶（hel
11、icase),利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。,Putian University,12级临本,23,（2）单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,单链DNA结合蛋白,Putian University,12级临本,24,(3）DNA旋转酶(topoiSOmerase，又称拓扑异构酶),能改变DNA空间构型的酶，既具有水解、又能连接磷酸二酯键的特点。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，均需DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺DNA链
12、，使复制能顺利进行。,Putian University,12级临本,25,拓扑异构酶的类型及功能,4、引物酶(primase),引物酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP)，能在DNA复制起始时催化合成一小段RNA作为引物(primer)。,Putian University,12级临本,26,作用方式：连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。,四、DNA连接酶（DNA ligase）,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,Puti
13、an University,12级临本,27,The Process of DNA Replication in Prokaryotes,第 三 节,原核生物DNA复制过程,Putian University,12级临本,28,原核生物、真核生物和病毒中DNA复制的过程基本相同，大致包含3个阶段：复制的起始、复制的延长、复制的终止。包括以下几个步骤：,（1）模板DNA双链解开,（2）RNA引物的合成,（3）DNA链的延长,（4）切除引物,DNA复制的步骤,（5）填补缺口,（6）连接相邻DNA片段,Putian University,12级临本,29,一、复制的起始,（一）、解旋解链，形成复制叉
14、：,解链：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。,稳定单链：单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,Putian University,12级临本,30,在原核生物DNA复制的原点（Ori C）富含AT序列，存在两个系列的重复单位：三个13bp构成的串联重复序列和四个9bp构成的反向重复序列。,原核生物的DNA复制起点结构,Putian University,12级临本,31,Putian University,12级临本,32,引发体是DNA复制起始时所形成的一种起始复合 物，由引物酶和几种相关蛋白（如
15、大肠杆菌 的DnaA,DnaB,DnaC）及单链结合蛋白组成。,（二）、引发体的形成与引物的合成,复制起始的主要任务是形成起始复合体(引发 体)，合成引物。,Putian University,12级临本,33,引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。,Putian University,12级临本,34,在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,引物,引物酶,合成引物,Putian University,12级临本,35,复制的延伸指在DNA聚合酶催化下，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP
16、以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。,二、DNA链的延伸,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。,Putian University,12级临本,36,原核生物DNApol催化前导链与随后链的合成,Putian University,12级临本,37,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,三、复制的终止,Putian University,12级临本,38,三、复制的终止,由RNA酶水解去除RNA引物；由
17、DNA聚合酶催化延长缺口处的DNA，填补缺口。,（1）去除引物，填补缺口：,（2）连接冈崎片段：,在缺口的最后一个磷酸酯键由DNA连接酶的催化生成，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,Putian University,12级临本,39,DNA复制过程简图,Putian University,12级临本,40,真核生物DNA生物合成过程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes,第 四 节,Putian University,12级临本,41,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉 前进 速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合
18、 酶/转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H 和FEN1等。RNAse H切除RNA引物，但在冈崎片段上保留一个核糖核苷酸,FEN1切除冈崎片段上保留的一个核糖核苷酸,真核生物与原核生物DNA复制的差异：,Putian University,12级临本,42,复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和 pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复 制因子(replication factor,RF)。,（一）真核生物复制的起始与原核基本相似,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）：在复制起始和延长中起关键作用。具有与E.c
19、oliDNA聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在复制因子RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。,Putian University,12级临本,43,DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过PCNA的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol，继续合成DNA子链。,（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,Putian University,12级临本,44,
20、真核生物DNA复制的末端问题,1、染色体DNA呈线状，复制在末端停止,2、连接不连续片段,Putian University,12级临本,45,端粒（telomere）DNA及端粒酶,端粒：真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,1、结构特点：,1）由末端单链DNA序列和蛋白质构成,2）末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。,2、功能,1）维持染色体的稳定性。,2）保证染色体末端DNA复制的完整性。,Putian University,12级临本,46,端粒酶（telomerase）,1、一种由RNA和蛋白质组成的复合物,2、一种特殊的逆转录酶,能依赖自身的RNA 为模板逆转录合
21、成端粒DNA,特点：,功能：,染色体线性DNA复制终止时，末端有可能缩短，但通过端粒酶的作用，可以补偿这种由于去除引物而引起的末端缩短。,以自身RNA为膜板逆转录合成端粒DNA。,端粒酶：负责端粒延长的一种酶。,Putian University,12级临本,47,端粒酶的爬行模型（动画演示）,Putian University,12级临本,48,逆转录和其他复制方式Reverse Transcription&Other DNA Replication Ways,第五节,Putian University,12级临本,49,Putian University,12级临本,50,逆转录作用（re
22、verse transcription）：RNA指导下的DNA合成作用，以RNA为模板在逆转录酶催化下，由dNTP聚合成DNA的作用，新生DNA分子存有RNA基因组的信息。,体系：RNA模板、反转录酶、引物tRNA、dNTP Zn2+,一、逆转录,RNA病毒的复制方式为逆转录，是一种特 殊的复 制方式,Putian University,12级临本,51,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,逆转录酶是一种能催化RNA合成DNA的酶，合成方向53。具有三种酶的活性：,1、依赖RNA的DNA 聚合酶活性。2、RNA水解酶活性。3、依赖DNA 的DNA 聚合酶活性。,Putian University,12级临本,52,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA,Putian University,12级临本,53,二、逆转录病毒与疾病,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,
