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1、细胞遗传学实验室质量管理手册人精子染色体荧光原位杂交（FISH）标准操作规程文件编号：SOP(技)4024第1页 共5页第2版第0次修改第 8 章批准人：年 月 日审核人：年 月 日人精子染色体荧光原位杂交（FISH）标准操作规程一. 目 的：建立双三色FISH，研究人精子染色体的非整倍体，以及染色体倒位、易位患者所产生配子的情况。二. 实验材料：(一). 实验具器：有刻度离心管、吸管、载玻片、盖玻片、6个立式染缸、小镊子、胶水、玻璃笔。(二). 仪器设备：恒温箱、水平离心机、斜式离心机、荧光显微镜、相差生物显微镜，恒温水浴箱、变性杂交仪（Vysis公司） 。(三). 试剂及配制：1. 试剂和
2、药品：美国Vysis公司的染色体计数探针（Chromosome enumeration probe CEP）、20SSC(32-804850)500g、NP-40(32-804818)21000ul 生理盐水、 6mM EDTA的PBS、 DAPIcounterstain(32-804831)2500ul(125ng/ml)、 无水洒精（100% ethanol）、1N NaOH 、纯水（distilled water，H2O）。2. 试剂和药品的配制：1) 20SSC溶液：132g 20SSC加入400ml蒸馏水（H2O）中，混匀，然后加蒸馏水至总量500ml。调节PH5.3，室温保存。有效
3、期为6个月。2) 2SSC溶液：850mlH2O中加入100ml 20SSC，混匀，然后加入H2O至总量1000ml。调节PH7.00.2，室温保存。有效期为6个月。3) 2SSC/0.1%NP-40溶液：850ml H2O加入20ml 20SSC溶液，混匀，再加入1mlNP-40，然后加H2O至总量1000 ml。调节PH7.00.2，室温保存。有效期为6个月。4) 0.4SSC/0.3 %NP-40溶液：950ml H2O加入20ml 20SSC，混匀，再加入3mlNP-40，然后加入H2O至总量1000ml。调节HP7.0-7.5 ，室温保存。有效期为6个月。三. 操作步骤：1. 标本的
4、准备1) 取材：患者（或自愿献精者）排精后禁欲3-7天，以手淫法将精液收集在洁净的干燥取精杯中，按WHO的标准化精液分析法进行常规精液分析。2) 洗涤精子：取1ml已液化的精液置于1.5ml的EP管中，以2000rpm/min离心5min，弃上清，用6mM EDTA的PBS混均， 2000rpm/min离心5min，弃上清。根据情况可重复洗涤23次，以便于去除精浆及杂质。3) 固定：加入1ml 新鲜固定剂（甲醇：乙酸3：1），室温5min，2000rpm/min离心5min，弃上清。反复固定共2次，最后用固定剂重悬，使精子的密度为10-20106精子/ml。4) 滴片：取密度为10-20106
5、精子/ml悬液滴片，37恒温箱烘干。5) 去凝聚：把标本片放置于1N NaOH的染缸10分钟，然后蒸馏水冲洗，室温晾干。在相差显微镜下观察，以处理后的精子头膨胀大小为处理前的1.5倍为好。6) 系列酒精脱水：标本置于2SSC溶液中，室温2min；接着置于系列洒精（70%，85%，100%）中脱水各2min。空气晾干。2. 探针的准备：采用雅培VYSIS公司的探针，CEP X Spectrum Green(绿色荧光FITC）、CEP Y Spectrum Orange(橙色荧光Texas red）、CEP 18 Spectrum Aqua(浅蓝色荧光Aqua)，Buffer杂交液。以CEPX:
6、CEPY: CEP18:Buffer=1:1:1:7 的比例配制探针混合液10ul，备用。3. 吸取10ul探针混合液加在已做好标记杂交区域，盖上盖玻片，用橡胶胶水封片，待干。注意封片时避免气泡产生，以免影响探针与标本杂交。4. 变性/杂交：将把标本片置于变性/杂交仪上，变性75,3分钟，杂交42,4小时或过夜。5. 洗脱：去除盖玻片与封胶后，将标本片置于75 的0.4%SSC/0.3乙二苯基聚乙二醇（Nonidet P-40）2分钟，然后置于室温下的2SSC/0.1% NP-40中1分钟，洗脱非特异性杂交。6. DAPI复染： 吸取10ul DAPI（4，6-Diamidino-2-plenylindole）加在杂交区域上，盖上盖玻片，室温放置10分钟。7. 荧光显微镜观察：在配备有Green/Orange/Aqua/DAPI四个滤光器的荧光显微镜下阅片。四注意事项：(一). 注意标本去凝聚化程度；(二). 缓冲液的值以及实验过程温度。(三). 探针、杂交液、含有诱变剂，做好防护措施。(四). 探针荧光染料见光容易分解，建议实验过程尽可能减少光线照射。
