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1、ICS点击此处添加ICS号SB中华人民共和国国内贸易行业标准SB/T XXXXX2012肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法Species identification of porcine, bovine, sheep, horse, donkey, chicken, duck, goose and rabbit derived materials in meat and meat products RT-PCR method点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施中华人民共和国商务部发布前言本标
2、准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由中华人民共和国商务部提出并归口。 本标准起草单位： 本标准主要起草人：肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法1 范围本标准规定了运用实时PCR技术对肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定方法。本标准适用于肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速定量鉴定。本标准中所建立的检测方法对猪、牛、羊、马、兔源性成分DNA的检测下限为0.001 ng/L，对驴、鸡、鸭、鹅的检测下限为0.01 ng/L。注：本标准中“肉及肉制
3、品”主要指新鲜肌肉组织或经过初步加工的生肉制品。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SN/T 1193 基因检测实验室技术要求GB/T 21103-2007 动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法 实时荧光PCR方法3 术语、定义和缩略语3.1实时荧光 PCR real time PCR实时荧光聚合酶链式反应。3.2Ct值 cycle time
4、每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 原理 采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA的细胞色素氧化酶b（cytochrome oxidase subunit b，cytb）基因上畜禽各物种间序列差异而进行动物源性成分鉴定。以Genbank上公布的猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔的cytb基因序列，设计合成检测各自的特异性引物对；利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板，使用各物种的特异性引物进行实时荧光PCR扩增，并通过标记报告基因6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein, FAM）、淬灭基因6-羧基四
5、甲基若丹明（6 - carboxyl tetramethyl rhodamine, TAMRA）的探针进行特异性杂交。观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对肉及肉制品中的动物源性成分进行快速测定。5 试剂和材料 试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T 27403-2008和SN/T 1193的规定执行。除另有规定外，试剂应为分析纯或化学纯级别，实验用水应符合GB/T 6682的要求。部分试剂的配制方法可参考附录A的介绍。5.1 猪源性成分检测用引物（对）序列为：FP（正向引物）：5- CGACAAAGCAACCCTCACAC-3RP（反向引物）：5- TGCGAGGGCGGTAATGAT-3P
6、ro（探针）：5 FAM- CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-TAMRA 35.2 牛源性成分检测用引物（对）序列为：FP：5- CTCCTCGGAGACCCAGATAAC -3RP：5- AGAAGTATCACTCGGGTTTG -3Pro：5 FAM- CCAGCCAATCCACTCAACACACCC-TAMRA 35.3 羊源性成分检测用引物（对）序列为：FP：5- CAGCCCTCGCCATAGTTCAC -3RP：5- AGGGTGGAAGGGAATTTTATCTG -3Pro：5 FAM- TCTTCCTCCACGAAACAGGATCCAACA-TAMRA
7、35.4 马源性成分检测用引物（对）序列为： FP：5- CCAATGCGTATTCTGACTCTTAGTG -3RP：5- CGATAATTACGTATGGGTGTTCC -3Pro：5 FAM- CTGACACTAACATGAATCGGCGGACAGC-TAMRA 35.5 驴源性成分检测用引物（对）序列为：FP：5- CCTCAGCACTCCCCCTCAT -3RP：5- AAGGATAAGGGCTAATACACCA -3Pro：5 FAM- CCAGAATGGTATTTCCTATTTGCTTACGCC-TAMRA35.6 鸡源性成分检测用引物（对）序列为：FP：5- CGACAACCC
8、AACCCTTACC -3RP：5- AGGAAGGTGAGGTGGATGATA -3Pro：5 FAM- ACACTTCCTCCTCCCCTTTGCAATCGC-TAMRA35.7 鸭源性成分检测用引物（对）序列为：FP：5- GGCCACACAAATCCTCACAG -3RP：5- TGTGTTGGCTACTGAGGAGAAA -3Pro：5 FAM- CCTACTGGCTATGCACTACACCGCAGAC-TAMRA35.8 鹅源性成分检测用引物（对）序列为：FP：5- AGACAATCCAACCTTAACCCGA -3RP：5- GGACTAGGGTGATTCCTGCA -3Pro：
9、5 FAM-CCATCCACTTCCTACTGCCCTTCCTA-TAMRA35.9 兔源性成分检测用引物（对）序列为：FP：5-GTTCTCGTCGCAGATCTTCTCA -3RP：5- TACTTGTCCAATGGTGATGAAC -3Pro：5 FAM- CACTCACATGAATCGGAGGCCAACCAGTA-TAMRA35.10 液氮。5.11 DNA提取裂解液：1CTAB(cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)Tris:tri (hydroxymethyl) aminomethan
10、e，三（羟甲基）氨基甲烷，0.7 mol/L NaCl，0.01 mol/L EDTA（pH 8.0）(ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)。5.12 TaqMan Gene Expression Master Mix。6 仪器和设备6.1 天平：量程 2 kg，感量 0.1 g；量程 100 g，感量 0.001 g。6.2 组织捣碎机。6.3 研钵。6.4 恒温水浴锅。6.5 台式冷冻离心机：离心力 12000g。6.6 微量移液器：量程分别为：0.1 L-2.5 L、0.5 L-10 L、10 L-100 L、50 L-200 L。6.7 pH
11、计。6.8 核酸蛋白分析仪。6.9 实时荧光PCR检测系统。6.10 实时荧光PCR反应管。7 样品制备在样品粉碎区进行。样品的采集和制备是肉及肉制品中肉种成分鉴别的重要步骤，为了防止交叉污染，应使用一次性消耗品，研钵应经 160 干烤2 h，其他不宜干烤或高压处理的器皿应使用1%次氯酸钠溶液浸泡。取样应尽量采取肌肉组织。对于同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取DNA。采样过程应快速完成，将采取的样品迅速放入组织捣碎机中进行均质成糜状，充分混匀。取 0.1 g充分混匀的样品，放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化。8
12、 检验步骤8.1 样品的总DNA提取在样品制备区进行，同时设立一种已知肉品作为提取方法的质控对照。a）将研钵移入 65水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加入 700 LDNA提取裂解液，研磨 30 s；b）65 水浴 3 h，期间不时振荡混匀；c）12000 rpm离心 5 min，取上清至新的 1.5 mL离心管内；d）加入等体积酚，充分混匀后，12000 rpm离心5 min；e）取上清，加等体积三氯甲烷:异戊醇（体积比 24:1），充分混匀，12000 rpm离心 5 min；f）取上清，加2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积的 3 mol/L 醋酸钠混匀，-20 静置 1 h，12
13、 000 rpm离心 5 min，弃去上清；g）用70乙醇洗涤一次，晾干，加入 50 LTE缓冲液，溶解沉淀；h）运用紫外分光光度计对提取的DNA进行测定，OD260 /OD280 在1.8-2.0之间时，适宜于PCR扩增。也可用等效的商品化试剂盒提取组织DNA。8.2 PCR检测8.2.1 扩增试剂准备在扩增区进行，在低温条件下进行体系配制。每个样品测试反应体系配制如下( 20 L反应体系)：Master Mix(2) 10.0 L上游引物FP（优化浓度） 2.0 L下游引物RP（优化浓度） 2.0 L探针Probe 2.0 L模板DNA Template（50 ng） 1.2 LDd H2
14、O 2.8 L向每个PCR反应管中加入以上反应混合液，转移至样品制备区。注：阳性对照用相应组织的DNA作为模板，阴性对照用不含相应成分的样品作为模板，空白对照用等体积去离子水作为模板。8.2.2 加样在样品制备区进行。在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备好的模板DNA溶液，盖紧管，离心 5 s10 s。8.2.3 实时荧光PCR检测在检测区进行。将8.2.2中离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：50 2min95 10min40（95 15s60 1min）收集荧光。检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。8.2.4 质控标准检验
15、过程中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照用相应组织的DNA作为模板，用不含相应成分的样品作为阴性对照，用等体积去离子水作为模板空白对照。9 结果判定9.1 结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。9.2 结果判定与表述9.2.1 结果的判定 9.2.1.1 有效性原则空白对照：无FAM荧光信号检出，未出现典型的扩增曲线。阴性对照：无FAM荧光信号检出，未出现典型的扩增曲线。阳性对照：有FAM荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，同时应满足以下：猪、牛、羊、马、兔检测体系的Ct值应小于35.0，驴、鸡、鸭、鹅检测体系的Ct值应小于30.0。以上应同时满足，
16、否则本次实验无效。9.2.1.2 样品有FAM荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，同时应满足以下：猪、牛、羊、马、兔检测体系的Ct值应小于35.0时，驴、鸡、鸭、鹅检测体系的Ct值应小于30.0时，判断样品为阳性。9.2.2 结果的表述 结果表述为“检出猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分。”和“未检出猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分。”9.2.3 测定低限 在上述条件下，本方法本标准中所建立的检测方法对猪、牛、羊、马、兔源性成分DNA的检测下限为0.001 ng/L，对驴、鸡、鸭、鹅的检测下限为0.01 ng/L。10 防止污染的措施检验过程中应严格防止交叉污染，防止交叉污染的措施按照SN/T 1193执行。11 废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。AA附录A（资料性附录）试剂配制A.1 DNA提取裂解液A.1.1 成分1（W/V）CTAB，十六烷基三甲基溴化铵 0.05 mol/L Tris，三（羟甲基）氨基甲烷 0.7 mol/L NaCl 0.01 mol/L Na2EDTA，乙二胺四乙酸二钠。A.1.2 配制（配制量1 L）称量CTAB 10 g，Tris 6.1 g，NaCl 41 g， Na2EDTA 3.7 g 置于1 L烧杯中，加入去离子水约 800 mL，充分搅拌混匀，加去离子水定容至 1 L后，室温保存。
