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1、转基因抗虫棉,抗虫棉,普通棉,专题一基因工程,基因工程的概念,基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程的概念,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,毒蛋白基因(目的基因）,与运载体DNA拼接导入,棉花细胞(含毒蛋白基因),棉花植株(有抗虫特性),基因工程培育抗虫棉的关键步骤是什么？,关键步骤一：,抗虫
2、基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与运载体DNA连接,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,关键步骤一的工具：基因的剪刀限制酶,关键步骤二的工具：基因的针线DNA连接酶,关键步骤三的工具：基因的运载工具运载体,（1）识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。,4000种。,形成两种末端,一、“分子手术刀”限制性核酸内切,（2）使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,酶,为什么强调主要是从原核生物中分离纯化出来的？,限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论
3、是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。图1-1 限制酶识别序列的中心轴线,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶EcoRI能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,什么叫做黏性末端?,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,二、“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,两类,磷酸二酯键,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合
4、”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？,（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；
5、而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体：,练习答案,2和7能连接形成ACGT TGCA；4和8能连接形成GAATTC CTTAAG；3和6能连接形成GCGC CGCG；1和5能连接形成CTGCAG GACGTC。,迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都
6、是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵,基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是
7、否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作
8、，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,课本知识回顾,基因工程又叫做 或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 提取出来，加 以，然后放到另一种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。,基因拼接技术,DNA重组技术,基因,修饰改造,定向地,DNA 重组技术的基本工具,“分子手术刀”,“分子缝合针”,“分子运输车”,限制酶,DNA连接酶,基因进入受体细胞的载体,限制性核酸内切酶,主要是从 的一种酶。识别双链DNA 分子的某种，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。形成两种末端,原核生物中分离纯化出来,特定的核苷酸序列,磷酸二酯键,粘性末端,平末端,二、“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,两类,Ecoli DNA连接酶,T4 DNA连接酶,磷酸二酯键,基因进入受体细胞的载体,通常有三种:在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在 基础上进行过 的,质粒,噬菌体衍生物,动植物病毒,天然质粒,人工改造,
