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1、血红蛋白醋酸纤维薄膜碱性电泳,实验四,1.掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作2.了解血红蛋白的组成及分类,一、实验目的（Experimental Objectives）,电泳：指带电胶体粒子或分子在电场的作用下，作定向移动。由于各种物质的等电点不同，在同一P环境中解离后所带电荷性质及电量多少也各不相同,再由于其分子量、结构、形状大小各有差异，因此在同一电场中泳动速度也不一样。一般来说，所带电荷多、分子量小、形状越接近球形者，泳动速度快，反之则慢。,电泳技术的分类：主要归纳为；,1）显微电泳即在显微镜下观察胶体粒子或细胞的移动度，也称细胞电泳。2）自由电泳即悬浮在介质中的细胞和生物大分子，在电场作用下自
2、由定向移动。,3）区域电泳（区带电泳）：即在不同电力条件、支持物上进行直接分离，鉴定生物物质，促使获得各自电荷差异的生物粒子形成各自区域以帯形停留在载体上。如：滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等，此类 电泳技术分离技巧简便，运用十分广泛。4）免疫电泳：即抗原与抗体在比例合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免疫技术，亲和电泳即属此类。,根据缓冲液的性质不同可分为：,1.连续系统：电泳缓冲液的离子成分、PH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。2.不连续系统：电泳缓冲液离子成分、pH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相同，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、
3、电荷效应、分子筛效应。,血红蛋白（Hb)的组成及分类：血红蛋白（Hb)：由亚铁血红素、珠蛋白 组成。每个珠蛋白分子由4条多肽链构成，根据其一级结构的不同可分为、四种类型。,正常成人Hb种类：组成 百分含量 pIHbA 22 9598%6.95HbA2 22 23%7.38HbF 22 6.95,二、实验原理(Experimental Principles),在pH8.6的环境中，Hb是一种带负电荷的蛋白质（Hb的pI 8.6），在电场中向正极泳动。电泳时，由于各种Hb等电点不同，所带电荷量不同；分子量大小、形状不同，导致各自的泳动速度不同，因而被分离。这种分离可初步鉴定不同的Hb。,醋酸纤维素
4、薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所有生物活性物质均能通过电泳得到分离。醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分离清晰、无拖尾、易定量等，已成为临床、实验室首选的方法。,。,三、实验材料、主要仪器和试剂（Equipments,Materials and Agents）,1、试剂 0.9%的NaCl溶液；蒸馏水；四氯化碳；碘酊；75%酒精；TEB缓冲液（pH8.6）；丽春红染液；漂洗液。2、实验器材 醋酸纤维薄膜；滤纸；电泳仪；一次性穿刺针；消毒棉签。,四、操作步骤（Operating Procedure）,1.取血：用2%碘
5、酊棉球消毒受试者手指，再用75%酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约50ul放入事先已加入0.9%NaCl 1ml 的1.5ml离心管中。如出血不畅，可对手指稍加挤压。,2.制备Hb液：1）洗涤红细胞：将上述离心管，颠倒混匀5-6次，4000rpm，离心3分钟。弃上清，再加1ml 0.9%NaCl悬浮红细胞，相同条件重复离心一次。2）溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水1滴，摇匀，再加入四氯化碳1滴，振荡混匀，相同条件再离心一次，取上清即得Hb液。,3.电泳1）膜条准备：2）点样：取出平衡好的膜条，用滤纸吸去多余的液体，然后平铺,（毛面朝上），用小玻片沾取适量Hb液，按印于点样线上，点样处离膜条边缘1.
6、5cm左右。,3）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面向下，上样一端靠近负极，盖严电泳室。通电预电泳5-10min。调节电压为100V，电泳3040分钟。4）染色：电泳完毕后关闭电源。将膜条取下，放在丽春红染色液中染色10分钟。5）漂洗：取出染色膜条，放入漂洗液中漂洗至凝胶背景无色为止。,五、结果与分析：（Results and Analysis）,观察膜条上Hb条带的位置及颜色的深浅。绘图纪录之。,六、临床意义,Hb醋酸纤维素薄膜碱性电泳可以筛选异常血红蛋病。异常血红蛋白：指珠蛋白链中一个或数个氨 基酸被置换、缺失或增加，造成血红蛋白结构及功能异常，导致一系列病理和生理改变。是常见的遗传病
7、之一.人类异常血红蛋白高达两千多种类型，约300人中即有一人是异常血红蛋白携带者。因此，在临床上快速、早期诊断尤为重要。,分子病 Gene突变导致蛋白质分子质和量异常，从而引起机体功能障碍的一类疾病，称为分子病。,异常Hb病：1、基因突变导致珠蛋白结构改变。镰状细胞贫血 2、基因突变导致珠蛋白肽链合成缺乏 或合成量异常。地中海贫血：、地贫,镰 状 细 胞 病,形成原因：链第6位谷氨酸被缬氨酸取代，形成HbS（镰状Hb)。在缺氧情况下，HbS聚合形成长棒状聚合物，使红细胞镰变,变形能力低，导致溶血、贫血，引起血粘度增高，血管梗阻性继发症状。发病的分子基础是：链基因的一个碱基对GAG(A)变为GT
8、G(T)，致使血红蛋白的链N端第6位的谷氨酸被缬氨酸取代形成HbS。,临床症状：血管阻塞的继发症状：一过性剧痛（腹痛、关节痛）,脑血管意外急性大面积组织损伤：心梗，肺、肾脏损伤；慢性溶血性贫血 患者多在成年以前死亡,地中海贫血由于珠蛋白基因的缺失或缺 陷使链的合成受到抑制而引起的溶血性贫血。特点：b 都表现为低色素性贫血,地中海贫血由于珠蛋白基因的缺失或缺陷使链的合成受到抑制而引起的溶血性贫血。,地中海贫血,最初发现在地中海地区居住的人群发病率特别高，因而称为地中海贫血。实际上世界各地都有发生，非洲和东南亚也比较常见。我国东南沿海地区高发。,血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳,一、实验目的（Experi
9、mental Objectives）：1.掌握血清脂蛋白电泳的基本原理及操作方法2.了解血清脂蛋白测定的临床意义,血清中的脂类物质均以不同的比例与载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，其颗粒大小相差也很大。,血浆脂蛋白的分类*,1电泳分类法：2超速离心法：乳糜微粒 CM-脂蛋白 VLDL 前-脂蛋白 LDL-脂蛋白 HDL,血浆脂蛋白的组成特点及功能*,二、实验原理(Experimental Principles)：,在pH 8.6的缓冲液中，脂蛋白带负电荷，在电场中向正极泳动。用琼脂糖凝胶作支持物进行电泳，各种脂蛋白因其所带的负电荷量及颗粒大小、形状等不同，
10、在电场中的泳动速度也不一样，故可将其分离，用不同方法显色便可进行定性、定量分析。,三、主要设备、实验材料和试剂（Equipments,Materials and Agents）,（一）试剂 巴比妥缓冲液（PH8.6 I=0.05）；制胶缓冲液（PH8.6 I=0.05）；0.45%琼脂糖凝胶；苏丹黑B染色液：制胶缓冲液（PH8.6 I=0.05）（二）设备 电泳仪和电泳槽；普通离心机；水浴箱；微量加样器等,四、操作步骤（Operating Procedure）,1预染血清：取Eppendof 管一支，加入血清0.2ml及苏丹黑B染料液0.02ml，混匀后置于37C水浴中预染30分钟，2000r
11、pm离心5分钟，取上清液备用。,2.制备琼脂糖胶板：将0.45%的琼脂糖凝胶，经高温溶化后，将胶模水平放置，插入上样梳。待琼脂糖凝胶液冷却至65左右时，小心倒入胶模中，使胶液缓慢、均匀展开，厚约0.5cm，室温下静置30 min，待凝固完全后，轻轻拔出上样梳，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。,3.点样：用微量加样器吸取预染血清约15l，加入凝胶样品槽内。4.电泳：加完样品后的凝胶板，立即通电。点样端置于负极。调电压100V，电泳约45分钟，观察到分开的电泳条带后关闭电源，取出凝胶板观察结果。,五、结果与分析（Results and Analysis）,肉眼观察各区带的颜色深浅、宽窄及其排列顺序
12、，绘出脂蛋白电泳图谱。正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从正极到负极依次为-脂蛋白、前-脂蛋白和-脂蛋白，原点处应为乳糜微粒。,CM,电泳法,密度法 CM LDL VLDL HDL,六、临床意义：,1.正常人血清脂蛋白琼脂糖电泳，可分离出三条区带，从正极到负极依次为-脂蛋白、前-脂蛋白和-脂蛋白，原点处应无乳糜微粒。且-脂蛋白含量-脂蛋白含量前-脂蛋白。2.参考值：-脂蛋白（LDL)：67%-脂蛋白(HDL)：2030%前-脂蛋白(VLDL)：028.6%,前-脂蛋白含量少时，在一般电泳谱上看不出来。正常人空腹血浆中虽有微量的乳糜微粒，但在一般电泳谱上也看不出来。血脂高于正常值上限即为高脂血症，可分为原发性和继发性两大类。原发性高脂血症原因不明，可能与遗传有关；继发性高脂血症是继发于其他疾病如糖尿病、肾病、甲状腺功能减退等。,临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM 前 正常型a型b型型型型,下次实验：,第三篇 生物化学与分子生物学实验第二十章 基础性实验实验12 血糖测定 P146实验15 血清总胆固醇测定P155,
