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1、DNA的生物合成,生物化学与分子生物学教研室 刘先俊,遗传信息流动的中心法则,第一节 复制的基本规律一、半保留复制（semiconservative replication）是DNA复制的基本特征 在DNA复制过程中，DNA双螺旋结构的两条多核苷酸链彼此分开，然后，每条链各自作为模板，在其上分别合成出一条互补链，这样，新形成的两个DNA分子（子代DNA）与原来DNA分子（亲代DNA）的核苷酸序列完全相同。在此过程中，每个子代DNA的两条链，一条来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种方式称为DNA的半保留复制。,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验:
2、,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,为了证实DNA分子中只有一条是新合成的，Meselson和Stahl将提取出的第1代大肠杆菌DNA加热处理，使其变性后仍通过CsCl超速离心分离，在紫外吸收扫描图上可见两个比重不同的紫外吸收峰，从而确证了第1代细菌的DNA是由两条比重不同的链所组成，排除了其它可能性。,更进一步证实了DNA的半保留复制。,模板原则特点,亲代的DNA双链，每股链都可作为模板按碱基配对原则指导新链的合成*合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一样*一条链来自于亲代的DNA链，另一条链是新合成的链,二、双向复制 原核生物复制
3、时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制中的DNA成为 状。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,三、半不连续复制（semidiscontinuous replication）1、体内仅存在5 3的DNA聚合酶2、前导链与随从链（岗崎片段）,领头链（leading strand）：DNA复制时，一股以3 5方向的母链作为模板，指导新合成的链以5 3方向连续合成的链称为领头链。（复制方向与解链方向一致）,随从链（laggin
4、g strand):DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5 3合成，1000-2000个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链。（复制方向与解链方向相反),岗崎片段（Okazaki fragment）：DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5 3合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称之为岗崎片段。岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。,半不连续复制：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3 5方向的母链作为模板指导新的链以5 3 方向连续合成，另一股以5 3 为方向的母链则指导新合成的链以 5 3方向合成10002000个核 苷酸长度的
5、许多不连续的片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复制。,第二节 DNA复制的酶学,一、核苷酸和核苷酸之间生成3，5-磷酸二酯键是复制的基本化学反应,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合 DNA聚合酶（DNA polymerase）在有DNA模板存在时，可催化合成DNA，因此，又称为依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymerase，DNA-pol）。1.原核生物的DNA聚合酶 1956年，Kornberg等人首次从大肠杆菌的提取液中发现了一种能催化合成DNA的酶，称为DNA聚合酶。,大肠杆菌DNA聚合酶有三种功能：第一、53的聚合作用。大肠杆菌DNA聚合酶
6、只能在引物的3端加上脱氧核苷酸，它是利用引物的3-OH与待加入的脱氧核苷三磷酸的5-磷酸基之间形成3,5-磷酸二酯键。已加入的脱氧核苷酸则仍有一个游离的3-OH，又可与下一个脱氧核苷三磷酸的5磷酸基之间形成3,5-磷酸二酯键,以后，按这种方式，DNA链不断延伸，因此，新链的合成方向是53，称为大肠杆菌DNA聚合酶的53聚合作用。,第二、35的外切作用（35exonuclease action）大肠杆菌DNA聚合酶除具有53的聚合作用外，也能催化从3-末端水解DNA链，而产生游离的单核苷酸，称为35的外切作用。其35的外切作用对DNA的聚合具有校正功能。错位接上去的碱基C会被DNA聚合酶的35的
7、外切作用水解掉，而DNA聚合酶再催化重新聚合上正确的碱基T。,第三、53的外切作用。大肠杆菌DNA聚合酶还具有53的外切作用。但这种外切作用不同于其35的外切作用：（1）首先，其裂解的键必须位于双螺旋区域。（2）其次，产物为单核苷酸或几个碱基组成的寡聚体。（3）53的外切作用随着DNA合成的进行而不断增强。（4）53的外切作用的酶的活性部位可与其聚合作用和35的外切作用的活性部位分开。大肠杆菌DNA聚合酶的53外切作用在DNA复制过程中用于去除引物。,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,DNA聚合酶5 聚合活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Kleno
8、w片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,可见，大肠杆菌DNA聚合酶的结构功能区可表示如下：53 35 53 外切作用 外切作用 聚合作用 53 35 53 外切作用+外切作用 聚合作用 小片断 大片断,C,枯草杆菌蛋白酶,N,继DNA聚合酶之后，1970、1971年又分别从大肠杆菌中发现了另外2种DNA聚合酶，分别命名为DNA聚合酶、。现将三种大肠杆菌DNA聚合酶的主要特性列于下表中。三种大肠杆菌DNA聚合酶的主要特性比较,2.常见的真核细胞DNA聚合酶有五种,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中
9、起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,真核生物的DNA聚合酶,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：1）遵守严格的碱基配对规律；2）聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3）复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,三.引物酶催化RNA引物合成 引物酶（primase）是一种特殊的RNA聚合酶。在DNA复制过程中，DNA聚合酶催化合成DNA时，需要一段带有3-OH末端的低聚核苷酸单链（体内为一小段RNA）作引物（primer），引物的碱基序列与模板DNA呈互补结合，引物的长度在原核生物如大肠杆菌通常只有1
10、6个碱基，在真核生物，通常也只有10个碱基左右。引物酶的作用即是利用四种核苷三磷酸（简称NTP）为底物，根据模板的碱基序列，按照碱基配对规则合成一小段RNA引物。,三.参与DNA拓扑学变化有关的蛋白质1.单链DNA结合蛋白(SSB):SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDP）。SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制中维持模板处于单链状态。,2.解螺旋酶(helicase):模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。解链酶作用是利用ATP供能，解开DNA双链。,3.DNA拓扑异构酶(topois
11、omerase):拓扑异构酶：是一类可改变DNA拓扑性质的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又能连接3,5磷酸二酯键。可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解链。,拓扑异构酶I（topo I）:在原核生物曾被称为蛋白。主要作用是将超螺旋DNA双股中的一股切断，酶仍停留在3断端，使链的末端沿着螺旋轴按超螺旋的反方向转动，DNA变为松弛状态（超螺旋消除后）再封闭切口。催化反应不需要ATP。,拓扑异构酶II（topo II）:在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。切断DNA双链，使另一双链经过此缺口，再封闭连接断端。无ATP参与时，使螺旋松弛。在ATP参与下，松弛的DNA进入负超螺旋。,原核生物复制起始相
12、关的蛋白质,四、DNA连接酶连接DNA中的单链缺口 可催化DNA链内缺口通过3,5-磷酸二酯键连接起来，在此过程中，需要消耗能量。该能量的提供者是ATP。,应用:1.岗崎片段之间的连接.2.DNA损伤修复中的连接.3.一种重要的工具酶。,第3节 DNA复制过程一、原核生物DNA复制过程（一）起始：DNA解链形成引发体，合成RNA引物。1.DNA解链 大肠杆菌复制起始点称为oriC,oriC序列分析发现，有3组串联重复序列和2对反向重复序列。,1）复制起始时，DnaA蛋白辨认oriC的识别区（串联重复序列）并与富含AT区（反向重复序列）结合，促使AT区解链；2）DnaB/DnaC使双链DNA解开
13、至足够长度，同时逐步置换出DnaA蛋白；3）SSB与单链DNA结合。,2.引发体与引物,引发体中，在引物酶催化下，以DNA为模板，合成短链的RNA分子（引物）。,领头链(leading strand)顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，得到一条连续的子链。,（二）复制的延长,随从链(lagging strand)复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。,冈崎片段(Okazaki fragment),随从链的模板DNA可以折叠或绕成环状，使同一DNA聚合酶（二聚体分子）同时分别催化领头链和随从链合成。,（三）复制的终止,去除RNA引物
14、填补空缺缺口连接,DNA聚合酶的小片段 5 3外切酶DNA聚合酶的大片段 3 5外切酶 5 3聚合酶DNA连接酶,二、真核生物DNA复制过程,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。,（一）真核生物复制的起始与原核基本相似,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA
15、聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase，CDK)。,哺乳类动物的周期蛋白和CDK,哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是CDK4
16、的特异性抑制物，P21蛋白能抑制多种CDK。锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点(check point)蛋白。,DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过PCNA的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol，继续合成DNA子链。,（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,真核生物DNA聚合酶/的转换,PCNA,真核生物DNA复制,（三）引物切除 在哺乳动物细胞中，DNA聚合酶缺乏5 3 核
17、酸外切酶活性，其引物分2步被去除：1.RNaseH1（一种对DNA-RNA杂合底物特异性的酶）行使内切酶的活性。2.FEN1(flap endonuclease-1 and 5exonuclease,活瓣内切核酸酶1和5 外切核酸酶)以外切酶活性降解RNA。,（四）端粒与染色体末端的复制,端粒指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)端粒酶协同蛋白,组成,端粒的复制模型 1989年Greider
18、和Blackburn提出了端粒的复制模型（爬行模型）。反应为四步进行：1)首先是端粒酶与端粒DNA结合，端粒酶中的RNA与凸出的3引物配对；2)以RNA为模板，在DNA3端上从头合成DNA；3)延伸六个nt；4)合成一个重复单位后，端粒酶向DNA模板新合成的3移动，引物再和模板配对，就这样循环往复，周而复始。最后延伸的3端再回折，以GG配对的方式形成发夹结构，产生端粒。,爬行模型：,端粒酶与老化：1986年Howard Cooke发现端粒长度在体细胞内比在生殖细胞内短。并发现端粒酶在生殖细胞内经常被表现出来，所以端粒的长度一直保持在15kb左右。胚性细胞和肿瘤细胞中端粒酶的活性很高，端粒的长度
19、就很长，而在体细胞中端粒酶无活性或活性低，端粒的长度也很短。,由于体细胞缺乏端粒酶活性，因此每分裂一次，端粒就缩短一些。当端粒缩短到一定长度的时候，影响到正常的基因，细胞必然死亡。这就是为何体细胞在体外培养到几十代以后，就不能传代，而癌细胞和生殖细胞几乎是永生的。将端粒酶基因转染到体外培养的人体细胞后，发现体细胞重新获得无限增殖能力。,Dolly（多莉）的DNA来自1头6岁成年羊的乳腺细胞的细胞核，提供DNA的乳腺细胞已在体外培养了几个星期。据测定，Dolly的端粒长度只有同年的通过正常生殖产生的羊端粒长度的80%。,五、逆转录 逆转录（reverse transcription）也称为反转录
20、。它是指以RNA为模板，按照RNA分子中的核苷酸顺序，以dNTP为原料合成DNA的过程。即将遗传信息从RNA到DNA的过程，这与遗传信息从DNA到RNA的转录过程相反。通过逆转录合成的DNA称为互补DNA（complementary DNA，cDNA）。,催化逆转录反应的酶是逆转录酶（reverse transcriptase），也称为RNA指导的DNA聚合酶（RNAdirected DNA polymerase，RDDP）。逆转录酶以dNTP为底物，需要一个具有3-OH的引物，同时需要2价金属离子（细胞的酶以Zn2+为主，病毒的酶以Mg2+为主）。逆转录酶为多功能酶，至少具有以下作用：1RN
21、A指导的DNA聚合酶作用：在有引物存在时，逆转录酶可以4种dNTP为底物，以RNA为模板，按53合成DNA，形成RNA-DNA杂合体 即RNA指导的DNA聚合酶作用。,2核酸酶H的活性即有核酸外切酶的作用。能特异性地水解RNA-DNA杂合体上的RNA，按53或35的方向均可进行，产物主要是5-末端磷酸化的含28个核苷酸残基的寡核苷酸。3DNA指导的DNA聚合酶作用：同样在有引物存在时，逆转录酶也可以4种dNTP为底物，以DNA为模板，按53合成DNA，形成双链DNA产物即DNA指导的DNA聚合酶作用。,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,六、DNA的损伤与修复（一）概述,外因,物理因素,化学因素,内
22、因,代谢过程,复制过程,损伤(突变),DNA分子的结构改变,自发突变,诱发突变(诱变),DNA修复的基础：一条链有损伤 修复酶切除 以未损伤的链为模板 合成原来相同的序列,（二）突变的后果1.突变是进化、分化的分子基础；2.只有基因型改变的突变形成DNA的多态性；多态性(polymorphism)一词用来描述个体之间的基因型差别现象。3.产生蛋白质分子的多态性；4.突变是产生遗传及相关性疾病的分子基础；5.致死性的突变可导致个体、细胞的死亡。,1.物理因素：紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射,（三）诱变的原因与作用,2.化学因素：,（四）突变的类型 生物机体DNA所发生的突变，
23、主要有以下几种类型：1点突变：为最常见的突变形式。它是指DNA分子中单个碱基的改变，如GGACTTCA变为GGAATTCA。,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,2.框移突变,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变。,缺失引起框移突变,3形成嘧啶二聚体：,4.重组（重排）,DNA分子内较大片断的交换称为重组或重排。如位于11号染色体上的Hb基因家族的重排引起地中海贫血。,（五）DNA损伤的
24、修复 生物机体对于损伤后的DNA，有不同的修复机制进行修复。修复机制可分为两大类：无差错修复（errorfree repair）和差错倾向修复（error-prone repair）。前者可使受损的DNA结构完全恢复正常，主要有直接修复、切除修复；后者在修复过程中，可能有突变的发生，主要有重组修复和SOS修复。,1、直接修复系统 如光复合等光复活作用：经可见光照射细胞后，细胞内的光复活作用酶能使嘧啶二聚体分解而恢复DNA原来的结构。光复合作用酶在生物界分别广泛，哺乳动物及人体内也有此酶的存在，但仅限于在淋巴细胞和成纤维细胞中发现，所以，光复活作用并非人体内主要的修复方式。,2、切除修复 切除修
25、复(excision repair)又称暗修复（dark repair），其修复过程无需光的参与。切除修复方式在生物界普遍存在，也是人体细胞主要的修复方式。其基本过程是：1)由特定的核酸内切酶特异性地识别受伤部位并与其结合，在损伤部位的5端切断其与正常DNA连接的3,5-磷酸二酯键。,2)DNA聚合酶同时发挥其53的外切作用，将包括损伤部位在内的一小段DNA切除掉。3)在DNA聚合酶的催化下，以DNA另一条完整的互补链为模板，从切口的3-OH开始，按53的方向修补DNA的缺口（即DNA聚合酶的53聚合作用）。4)DNA连接酶将新合成的DNA与原来的DNA连接起来称为完整的分子，DNA恢复其正常
26、结构。,着色性干皮病(XP),XPA、XPB、XPC等XP蛋白：共同参与辨认、切除受损DNA部位。DNA聚合酶：DNA-pol、修复受损DNADNA连接酶,3.重组修复又称复制后修复,4.SOS修复 SOS修复又称诱变修复（mutagenic repair）。当DNA分子受到较多范围的损伤，修复难以进行时，细胞处于危急状态，从而产生的一种特殊的修复方式，它用国际通用的遇难求救信号SOS命名。此时，DNA复制的短暂抑制可诱导产生一种特殊的DNA聚合酶，其识别碱基的能力很差，对模板要求低或无需模板存在即能催化DNA的合成。所以，对于双链断裂而空缺的DNA也能合成，但也导致错误的复制而引起基因的碱基
27、突变，然而却提高了细胞的存活率。即在危急情况下，以牺牲复制的准确性而换取细胞的生存，这是SOS修复的主要特点。在哺乳动物细胞中，也有这种修复方式。,本章主要内容,一、DNA的生物合成1.复制的基本规律 半保留复制、半不连续复制、双向复制概念2.DNA复制的酶学和拓扑学变化 DNA聚合酶、引物酶、DNA连接酶、单链DNA结合蛋白、解螺旋酶、DNA拓扑异构酶及其作用3.DNA复制过程1）原核生物DNA复制的基本过程：复制起始区结构特征及作用，起始过程的主要变化2）端粒概念、端粒酶组成4.逆转录 概念、逆转录酶及其作用5.DNA损伤与修复1）突变（损伤）概念2）突变类型3）修复光修复系统特点、切除修复系统的主要过程,
