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1、MDR1 C3435T 基因多态性与癫痫药物抗性的关系探究,分子医学技能 实验设计 组员：王宗明 谢咏科 冯泽雄 石健庭,研究背景,癫痫（Epilepsy)：癫痫是多种病因导致的以脑部神经元过度的超同步化发放所致的突然发生的短暂性的脑功能障碍。可有多种原因引起，如肿瘤、外伤、原发性等。大部分可经药物治疗而有效控制甚至痊愈。,研究背景,药物抗性癫痫（Drug resistant epilepsy,DRE)20%30%的癫痫患者通过现有的抗癫痫药物（anti-epileptic drugs，AEDs）无法达到有效的治疗效果，成为药物抗性癫痫或称为难治性癫痫。,研究背景,P糖蛋白（P glycopr
2、otein，Pgp）P糖蛋白是一种存在于细胞膜上的能量依赖性外排泵，可将亲脂性药物泵出细胞外。由多耐药（Multi-drug resistance，MDR）基因MDR1编码。存在于多种有分泌功能的组织和屏障结构中,如肠粘膜、血脑屏障（血管内皮、星形胶质细胞）。,研究现状,Pgp与DRE的关系：不同原因引起的DRE患者相比一般癫痫患者，脑组织中Pgp表达量明显升高。动物实验得到相似的结果。Pgp高表达的实验动物脑组织中药物浓度降低。Pgp拮抗剂部分或完全逆转此效应。,研究现状,MDR1基因多态性与DRE：26号外显子中的MDR1基因3435C T。可影响十二指肠上皮细胞中Pgp表达量与活性，从而
3、影响药物的吸收。与DRE的关系存在矛盾的结果。,设计思路,排除干扰，“纯化”结果：病因药物年龄种族性别,研究目的与意义,明确MDR1 C3435T基因多态性对癫痫耐药性的影响。排除癫痫病因及药物种类对结果的影响。对癫痫耐药理论研究及指导临床对不同基因型病人的用药均有一定意义。,实验方法,PCR-RFLP限制性片段长度多态性分析,实验试剂与仪器,试剂：血浆微量DNA提取试剂盒、DNA琼脂糖凝胶电泳所用试剂、PCR反应所需酶及引物仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、染色缸、漂洗缸、紫外检测仪、EP管、微量移液器,实验步骤,研究对象：不同病因、不同药物治疗的癫痫患者正常对照志愿者汉族取外周血5m
4、l分组标准：患者以用药后癫痫发作频率是否低于用药前50%,实验步骤,基因型检测（PCR-RFLP法）：外周血DNA提取PCR扩增酶切琼脂糖凝胶电泳,实验步骤,1.外周血DNA提取：取抗凝血1ml3000rpm15min，取上清100l加入200lDP1液，充分混匀，静10min加入300lDP2液，颠倒混匀12000rpm10min,取上清加等量异戊醇，10000rpm10min，去上清75%乙醇洗涤，溶于10lTE缓冲液,实验步骤,2.PCR扩增PCR反应体系：10buffer 5l4种dNTP混合物（每种2.5 mmol/L）4l引物：MDR-1F(5-ACTCTTGTTTTCAGCTGC
5、TTG-3)0.67M MDR-1R(5-AGAGACTTACATTAGGCAGTGACTC-3)0.67M模板DNA 2lTaqDNA聚合酶(3U/l)1lMg2+(25 mmol/L)3l去离子水 32l,实验步骤,2.PCR扩增取五支PCR反应管（内有缓冲液、原料、引物、聚合酶），分别加入已经处理好的标本DNA 2ul。6000rpm5s离心。放入PCR仪进行扩增。,实验步骤,2.PCR扩增PCR程序初次变性 94 5min循环33次 变性 94 30s 复性 56 20s 延伸 72 30s末次延伸 72 5min最终将得到231bp包含3435核苷酸的基因片段。,实验步骤,3.酶切：
6、向PCR扩增产物中加入限制性内切酶Sau3AI 37 过夜。,实验步骤,4.琼脂糖凝胶电泳：（1）琼脂糖凝胶板的制备：1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。,实验步骤,4.琼脂糖凝胶电泳：（2）电泳样品液的制备：用移液器分别吸取五管中的PCR扩增产物10l于封口膜上，再加入2l 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）电泳：打开电源开关，调节电
7、压至3-5V/cm，电泳约30min-60min。（4）染色与检测：将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护罩，打开紫外灯，观察。,观察指标,观察特异性条带。野生型等位基因（即C）被切割为163bp和68bp的两个片段。突变等位基因（即T）不被切割，仅得到一条231bp片段。,观察指标,CC,CT,TT,68bp,163bp,231bp,结果分析,统计药物抗性癫痫组、普通癫痫组与正常对照组中各基因型所占的比例。2 分析。再依据癫痫的病因及所用药物再分组，做组内及组间比较。,预期结果,在癫痫病因及所用药物形同的组内，普通癫痫患者与药物抗
8、性癫痫患者的基因型有统计学差异，药物抗性癫痫患者中TT基因型的比例更高。,分析,设计亮点及创新之处：方法简便易行。排除了药物及病因对实验结果的影响。不足之处：所需样品量过大，不易得到。创新性不强。,主要参考文献,P.Kwan et al.Association between ABCB1 C3435T polymorphism and drug-resistant epilepsy in Han Chinese.J.Epilepsy&Behavior,2007,11(1):112117.Samar I.Hamdy et al.Genotype and allele frequencies of
9、 TPMT,NAT2,GST,SULT1A1 and MDR-1 in the Egyptian population.J.Ltd Br J Clin Pharmacol,2003,55(6):560569.I.Mosyagin et al.Association of ABCB1 genetic variants 3435CT and 2677GT to ABCB1 mRNA and protein expression in brain tissue from refractory epilepsy patients.J.Epilepsia,2008,49(9):15551561.A.Sh
10、ahwan et al.The controversial association of ABCB1 polymorphisms in refractory epilepsy:An analysis of multiple SNPs in an Irish population.J.Epilepsy Research,2007,73(2):192198.J.R.Hughes.One of the hottest topics in epileptology:ABC proteins.One of the hottest topics in epileptology:ABC proteins.Their inhibition may be the future for patients with intractable seizures.J.Neurological Research,2008,30(9):920925.,MDR1 C3435T 基因多态性与癫痫药物抗性的关系探究,ANY QUESTION?,THANK YOU!,
