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1、DNA重组及重组DNA技术,第 二十一 章,DNA重组（DNA recombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。,2,第一节自然界的DNA重组和基因转移,DNA重组,4,同源重组(homologous recombination)位点特异重组(site-specific recombination)转座重组(transposition recombination)接合作用(co
2、njugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction),第二节 重组DNA技术,重组DNA技术的发展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗 传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重 要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工 厂。1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,6,9,一、重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,限制性核酸
3、内切酶(restriction endonuclease,RE)是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列,并裂解磷酸二酯键。,+,Bam H,10,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,Hin d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,11,类酶识别序列特点回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,12,Bam H,+,Hind,+,平端切口,黏端切口,13,定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些
4、DNA分子。,载体按功能分为 克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序 列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector)：为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为 表达载体。,14,二、重组DNA技术中常用的载体,质粒(plasmid)：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,常用的克隆载体,15,pUC18质粒载体图谱,16,17,原核表达载体的基本组成,R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列,表达载体,18,真核表达载体的基本组成,OriPro：原核
5、复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点；TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。,基本原理,目的基因的获取 克隆载体的选择和构建,外源基因与载体的连接 DNA导入受体细胞,重组体的筛选 克隆基因的表达,19,三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,20,21,目的基因的分离获取分载体的选择与构建选目的DNA与载体连接接重组DNA转入受体细胞转重组体的筛选与鉴定筛克隆基因的表达,22,（一）目的基因的分离获取分,1.化学合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸 序列。2.从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA3
6、.PCR法 4.其他方法,23,（二）载体的选择与构建选,DNA克隆的目的：化学合成法获得某一目的基因或DNA片段 获得目的DNA片段所编码的蛋白质,24,不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞,25,1.黏端连接(1)单一相同黏端连接(2)不同黏端连接(3)通过其他措施产生黏端进行连接,（三）目的DNA与载体连接接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,26,单一相同黏端连接,27,不同黏端连接（定向克隆）,28,人工接头及其应用,29,同聚物加尾连接,30,2.平端连接,31,受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)导入方式：转化(transform
7、ation)转染(transfection)感染(infection),（四）重组DNA转入受体细胞转,32,1.借助载体上的遗传标志进行筛选2.序列特异性筛选3.亲和筛选法,（五）重组体的筛选与鉴定筛,插入失活筛选带有重组载体的克隆,33,互补筛选（蓝-白筛选）,34,菌落或噬斑原位杂交筛选重组体,35,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,36,重组DNA技术操作的主要步骤,37,38,1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用)2.真核表达体系(酵母、昆虫、乳类动物细胞),（六）克隆基因的表达,第三节 重组DNA技术在医学中的应用,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。,40,一、重组DNA技术广泛应用于生物制药,重组DNA医药产品,41,疾病相关基因的发现与鉴定 转基因和基因打靶 加速了人类基因组计划的完成 疾病的基因诊断和基因治疗,42,二、重组DNA技术还应用于医学的其他诸多方面,
