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1、DNA重组技术的原理及步骤,第五组：郑桂贤,一、发展历史,1951年，美国学者E莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发现了抗药性质粒。20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯时，斯吉巴尔斯基在基因期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使用。,二、DNA重组技术的原理,1.目的基因的获取2.克隆载体的选择与构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体菌5.重组体的筛选6.克隆基因的表达,三、DNA重组技术的步骤,1.分：
2、分离目的基因 2.切：对目的基因和载体适当切割 3.接：目的基因与载体连接 4.转：重组DNA转入受体菌 5.筛：筛选出含有重组体的受菌体,Recombinant DNA Technology,从细胞中分离出DNA,限制酶截取DNA片断,分离大肠杆菌中的质粒,DNA重组,用重组质粒转化大肠杆菌,培养大肠杆菌克隆大量基因,重组体的筛选,（一）分：目的基因的获取,1.化学合成法:较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物、测序引物、核酸杂交探针、定点突变 2.基因组DNA、cDNA 3.聚合酶链反应,cDNA文库,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,基因组DNA文库,限制性内切酶,基因组DN
3、A,基因重组,转化细菌,体外包装,克隆载体的选择和构建,理想载体具备的条件：可转移性、复制功能、多克隆位点（广泛、特异）、显著的筛选标志，便于筛选和鉴定、安全性常用克隆载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子；具有自我复制功能；带有抗性基因及表型识别等遗传性标记;经改造后具有多克隆位点。pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,质粒载体,（二）切：对目的基因和载体适当切割,（1）
4、与DNA分子相关的几种酶及基因工程的其他工具,限制性内切核酸酶,在特异位点上切割DNA分子分三类，常用为类酶识别序列呈回文对称,5-GAATTC-33-CTTAAG-5,5-GTTAAC-33-CAATTG-5,EcoR的识别序列,Hae的识别序列,（三）接：目的基因与载体连接,(三)连接策略 1.粘端DNA 间的连接(1)同一限制性内切酶切割位点连接(2)不同限制性内切酶切割位点连接 2.平端DNA 间的连接 3.同聚物加尾连接 4.人工接头连接,粘端连接,CCGG CCGG,GGCC GGCC,CGG C,C GGC,CGG C,C GGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA连接酶,
5、平端连接,AGCT,TCGA,Alu,DNA连接酶,AGCT AGCT,TCGA TCGA,同聚物加尾连接,（四）转：重组DNA转入受体菌,无性繁殖 感受态细胞:容易接受外源DNA的状态.方式:转化、转染、感染,导入大肠杆菌 导入哺乳动物细胞,1.氯化钙转化法 2.电击法 3.体外包装感染法 1.显微注射法 2.电穿孔法 3.DNA-磷酸钙共沉淀 4.DEAE-葡聚糖转染法 5.病毒感染法 6.脂质体介导法 7.细胞融合法 8.原生质体融合法 9.微细胞介导法,（五）筛：筛选出含有重组体的受菌体,直接选择法 间接筛选法 核酸水平 蛋白质水平 1.抗药性选择*1.酶切图谱 免疫学的技术：*2.核
6、酸探针 SDS-PAGE、2.标志补救*3.PCR Western blot、3.分子杂交法*4.序列测定 ELISA、放免、免疫沉淀、荧光抗体等,抗药性选择,2）标志补救（-半乳糖苷酶法）,（LacZ基因）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ酶,氨苄培养基,(六)克隆基因的表达,原核表达体系表达载体的标准：1.含有大肠杆菌适宜的选择标志 2.具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子 3.含有适当的翻译控制序列 4.含有合理设计的多接头克隆位点 真核表达体系 关键步骤是将重组DNA导入真核细胞,质粒 噬菌体 病毒,PCR cDNA 人工合成 基因文库,限制性内切酶,有切口的载体,有切口的目的基因,DNA连接酶,重组体,转化 转染 体外包装,带重组体的宿主细胞,表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法,目的基因的表达,基因载体,目的基因,粘端连接 平端连接 尾接法,分 切 接 转 筛,总观,参考文章,张亚旭 DNA重组技术的研究综述 生物技术进展 2012年第2卷第一期 57-83张洪渊 生物化学教程 第七章 Page479王镜岩 朱圣庚 徐长法 生物化学下册 第40章Page580百度百科马克学 席兴宇 转化、转导、转染和感染的解析 生物学教学 2010（第35卷）第10期,谢谢观看,
