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1、2005-8-15,1,动脉粥样硬化免疫机制的研究进展,南华大学心血管病研究所 杨永宗2005.8.15.,2005-8-15,2,一、前 言,AS病变的炎症性质以及一系列炎性因子在AS病变形成中的关键作用几已成为共识。但数以百计的危险因素如何启动炎症过程而促成AS病变发生发展却还是个未解的问题。天然免疫的模式识别理论的提出将开辟AS病变发生发展机理研究的新领域。,2005-8-15,3,二、天然免疫模式识别理论要点,美国免疫学家Janeway提出天然免疫的模式识别理论，强调天然免疫对获得性免疫的指导和调控作用，指出抗原递呈细胞（APC）是紧密地连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。天然免疫系统通过
2、APC上的模式识别受体(PRR)识别病原相关分子模式(PAMP)，区别“自己”与“非己”及无害“非己”和病原体相关“非己”,并籍抗原递呈和共刺激信号两个环节赋予获得性免疫识别“自己”“非己”的能力。,2005-8-15,4,病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern）,PAMP是指一大组或某几大组病原体所共有的一种分子模式(molecule pattern)，而非某一特定结构。PAMP是病原体的保守结构成分且对其生存是必要的,如发生突变,将使病原体死亡或丧失致病性。PAMP不同于宿主机体自身成分。,2005-8-15,5,Janeway提出模式
3、识别理论，将天然免疫针对的主要靶分子信号称为病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern,PAMP），将其相应的识别受体称为模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）。PAMP主要指广泛存在于病原体细胞表面的分子标志，如酵母细胞壁上的甘露糖、以及各种细菌的细胞壁成分如脂多糖、多肽糖、胞壁酸等，这些分子在进化过程中都趋于保守。,2005-8-15,6,模式识别受体(pattern recognition receptor),与PAMP相应的识别受体称为模式识别受体（PRR）。已克隆的PRR大多属于Toll样受体
4、(TLRs)家族,清道夫受体特别是SR-A1也具有PRR功能。TLRs广泛表达在各种淋巴细胞表面，包括非特异性免疫细胞巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞，和特异性免疫淋巴细胞和淋巴细胞。其中单核细胞分化的树突状细胞是唯一表达所有5种TLR的细胞,也是唯一表达TLR3的细胞。,2005-8-15,7,1.病原微生物感染,相关病原体的研究包括肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒等。其中肺炎衣原体在AS斑块发生中的作用已有较多研究，但现在认为单一的病原体感染在AS中的作用可能很小，而多重感染并存则是影响心血管疾病的重要因素。,2005-8-15,8,内毒素的作用,Control
5、Group,Endotoxin Group,2005-8-15,9,GroupvWF(%)tPA activityPAI activity(Iu/mg protein)(Au/mg protein)Endotoxin0.5560.048*0.2270.048*5.360.28*Control0.1000.050 0.6430.0801.250.40*P0.05 compared with control.,内毒素对内皮细胞功能的影响,2005-8-15,10,Control,Coronary Artery from Patient,肺炎衣原体,2005-8-15,11,A1:ControlA2
6、:106 IFUs/L AR-39B1:10 mg/L LDLB2:10 mg/L LDL+106 IFUs/L AR-39C1:10 mg/L oxLDLC2:10 mg/L oxLDL+106 IFUs/L AR-39,肺炎衣原体对细胞胆固醇蓄积的影响,2005-8-15,12,A1:对照组 A2:cpn B1:LDL B2:LDL+cpn C1:ox-LDL C2:ox-LDL+cpn,肺炎衣原体对C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化的影响,2005-8-15,13,多重感染并存,流行病学资料显示，冠心病患病危险度与感染病原体的种类多少相关，而且存在多种感染是冠心病患者发生心肌梗死的
7、独立危险因素。现在认为单一的病原体感染在AS中的作用可能很小，而多重感染并存则是影响心血管疾病的重要因素。,Circulation.2001;103:45-51.Prospective Study of Pathogen Burden and Risk of Myocardial Infarction or Death,2005-8-15,14,2.氧化修饰低密度脂蛋白,A 对照组 B 实验组,小鼠腹腔巨噬细胞,猪主动脉平滑肌细胞,2005-8-15,15,人U937细胞,透射电镜照片,人外周血单核巨噬细胞,人THP-1细胞,2005-8-15,16,Proc.Natl.Acad.Sci.US
8、A Vol.92,pp.3893-3897,April 1995T lymphocytes from human atherosclerotic plaques recognize oxidized low density lipoprotein,2005-8-15,17,AS患者血清和斑块可检测到oxLDL抗体。斑块中分离出的CD4+T 细胞可识别oxLDL。oxLDL抗体可分为IgG和IgM型。IgG抗体水平增高与AS病变程度加重相关，而IgM型oxLDL抗体与AS病变呈负相关。,2005-8-15,18,用oxLDL免疫兔可减少40%50%AS病变，在apoE和LDLR敲除小鼠的研究中也
9、获得类似结果。Shaw 等人用肺炎链球菌感染LDLR缺乏小鼠，诱导小鼠体内高水平IgM型oxLDL抗体产生。伴随脾脏内B淋巴细胞持续分泌IgM增高，AS病变程度降低。用apoB-100肽链免疫apoE缺陷小鼠，可减少60%的AS病变形成，并特异性增加IgG抗体水平7。,Arterioscler Thromb Vasc Biol.2003;23:879-884.Inhibition of Atherosclerosis in ApoE-Null Mice by Immunization with ApoB-100 Peptide Sequences,2005-8-15,19,斑块内的OxLDL可
10、影响DC的成熟和活化，氧化过程产生的溶血磷脂酰胆碱（LPC）可直接通过G蛋白偶联受体途径诱导DC成熟。oxLDL还可以增加DC表面呈递抗原以及协同信号分子的表达。,The Journal of Immunology,2002,169:16881695.Mature Dendritic Cell Generation Promoted by Lysophosphatidylcholine,2005-8-15,20,3.热休克蛋白,HSP可与多种抗原肽结合产生免疫原性，诱导抗原特异性免疫反应。Berberian 最先报道在人类和兔斑块中存在HSP70，而且HSP的分布与斑块中细胞坏死、脂质聚集相关
11、。Kleindienst 研究表明颈动脉的内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞HSP60表达量与AS严重程度呈正相关。斑块中大量存在的T淋巴细胞对HSP60/65可发生特异性反应。临床研究也表明HSP60抗体与冠状动脉疾病严重程度相关，是冠脉临床事件发生的重要危险因素。,Arterioscler Thromb Vasc Biol.2002;22:1547-1559.Role of Heat Shock Proteins in Atherosclerosis,2005-8-15,21,微生物HSP65/60和人HSP60的抗体之间存在交叉反应，抗微生物HSP65/60的抗体可以引发自身免疫反应。除了广
12、泛关注的肺炎衣原体和巨细胞病毒编码HSP60与人HSP60分子模拟作用。除上述交叉反应引起免疫反应外，HSP可被TLR4识别通过天然免疫在AS发生中发挥关键作用。,Arterioscler Thromb Vasc Biol.2002;22:1547-1559.Role of Heat Shock Proteins in Atherosclerosis,2005-8-15,22,4.2糖蛋白I,2糖蛋白是一种含326个氨基酸的血浆蛋白，主要合成部位在肝脏，一般以游离形式存在于血浆，少量与脂质结合。2GpI是抗磷脂综合症（APS）的主要抗原。多种炎症性疾病，包括AS、狼疮、APS血浆中都能检测到抗
13、2GpI抗体，人AS斑块内也检测到2GPI。,DOMAIN STRUCTURE OF 2-GLYCOPROTEIN I,2005-8-15,23,George用人2GpI免疫LDLR-/-鼠，抗2GpI抗体显著增高，血管内皮下较多CD4+T细胞浸润，AS斑块形成明显加快。用2GpI免疫apoE-/-鼠也同样显示斑块形成速度加快，抗2GpI抗体水平增高。,Circulation.1998;98:1108-1115.Induction of Early Atherosclerosis in LDL-ReceptorDeficient Mice Immunized With b2-Glycoprot
14、ein I,2005-8-15,24,用2GpI免疫普通小鼠，再将其淋巴结和脾脏处的淋巴细胞注入LDLR-/-小鼠的腹腔，发现LDLR-/-小鼠早期AS斑块增加。说明2GpI通过淋巴细胞在动脉粥样硬化的形成中发挥作用。,Circulation.2000;102:1822-1827.Adoptive Transfer of b2-Glycoprotein IReactive Lymphocytes Enhances Early Atherosclerosis in LDL ReceptorDeficient Mice,2005-8-15,25,四、AS与天然免疫,天然免疫是机体的第一道防线，它通
15、过天然免疫效应细胞和效应分子发挥作用。天然免疫效应细胞包括单核/巨噬细胞、NK细胞，树突状细胞、肥大细胞、B1细胞等；天然免疫效应分子则有炎症介质、补体等。单核/巨噬细胞在AS发病中具有重要地位，其他效应细胞同样可能发挥一定作用。,2005-8-15,26,Kristina用半定量PCR和免疫组化方法发现，人AS斑块中TLR1、TLR2、TLR4表达明显增加，同时也伴随有NF-B的表达。推测TLRs在斑块炎症活化过程中天然免疫机制发挥作用。,Circulation.2002;105:1158-1161.Expression of Toll-Like Receptors in Human Ath
16、erosclerotic Lesions:A Possible Pathway for Plaque Activation,2005-8-15,27,TLR信号转导,TLR和PAPMs结合后形成二聚体,随后转接蛋白MyD88通过C末端的Toll/IL-1R（TIR）结构域与TLR的胞内段相互作用，介导LPS诱导的单核细胞或内皮细胞NF-B活化，激活细胞因子基因转录，介导共刺激信号B7分子表达，进而通过APC而活化细胞。TLR细胞内信号传导分子MyD88参与AS进程。MyD88缺乏可使斑块面积缩小，脂质成分降低，促炎介质以及细胞因子和趋化因子如IL-12和MCP-1的表达减少。,2005-8-1
17、5,28,Frank 分别以野生型牙龈卟啉单胞菌和毒性减弱的牙龈卟啉单胞菌菌毛缺失突变体(FimA-)感染apoE-/-小鼠。感染野生型牙龈卟啉单胞菌的apoE-/-小鼠AS斑块增加，主动脉壁TLR2和TLR4表达上调；而后者尽管在apoE-/-小鼠血液和主动脉弓组织内检测到FimA-突变株存在，但是没有出现TLRs表达上调，斑块病变无明显进展；提示由TLRs介导的天然免疫在AS发展中发挥重要作用。,Circulation.2004;109:2801-2806.)Innate Immune Recognition of Invasive Bacteria Accelerates Atheros
18、clerosis in Apolipoprotein EDeficient Mice,2005-8-15,29,清道夫受体,巨噬细胞清道夫受体在生物学方面的最新进展是发现，它既能识别感染性非自身物质（病原体），又能识别修饰后自身物质(凋亡样细胞和修饰后LDL)，是模式识别受体家族中的一员。AS斑块内的巨噬细胞表达大量清道夫受体。特别是SR-A，在天然免疫，凋亡样细胞的清除，以及组织自稳态方面也发挥着重要作用。,2005-8-15,30,SR-A1转基因鼠,转SR-A1的C57BL/6小鼠喂养高脂饲料24周后，主动脉瓣膜附着处血管壁增厚，明显的粘液样变性，冠脉内膜增厚，泡沫细胞聚集、中膜粘液样变
19、性；主动脉苏丹染色表明有明显的脂纹形成。,2005-8-15,31,Control group,transgenic group,Transgenic highcholesterol group,High cholesterol group,2005-8-15,32,小鼠主动脉粥样硬化斑块,2005-8-15,33,SR-A对ox-LDL诱导TPH-1细胞MMP-9表达的影响,明胶酶谱MMP-9活性1：对照2：OX-LDL3：OX-LDL+SR-A正义寡核苷酸4：OX-LDL+SR-A反义寡核苷酸5：OX-LDL+SR-A抗体,1,2,3,5,4,2005-8-15,34,SR-A对ox-LD
20、L诱导TPH-1细胞MMP-2活性影响,2005-8-15,35,SR-对ox-LDL诱导TPH-1细胞TIMP-1表达的影响,TIMP-1 Western Blot 1：对照2：OX-LDL3：OX-LDL+SR-A正义寡核苷酸4：OX-LDL+SR-A反义寡核苷酸5：OX-LDL+SR-A抗体,1,2,3,4,5,2005-8-15,36,肥大细胞,肥大细胞表达Fc-R，Fc-R，TLR-2，TLR-4，作为微环境感应细胞在天然免疫和获得性免疫都起直接作用。外源凝集素、补体活化产物C5a、C3a等多种刺激物均可通过Fc-激活肥大细胞。促进肥大细胞脱颗粒。活化的肥大细胞脱颗粒释放大量生物活性
21、物质，包括血管活性物质、中性蛋白酶、炎症因子和生长因子等，促进AS病变形成和破裂。,2005-8-15,37,Circulation.1996;94:2787-2792.)Mast Cells in Rupture-Prone Areas of Human Coronary Atheromas Produce and Store TNF-,2005-8-15,38,对照组 ox-LDL(48h),透射电镜,甲苯胺蓝染色,2005-8-15,39,对照组 实验组 主动脉病变HE染色,实验组 主动脉甲苯胺蓝染色,Compound48/80对apoE基因敲除鼠主动脉斑快的影响,2005-8-15,4
22、0,虽然NK细胞存在于斑块处的直接证据很少，但最近报道NK细胞功能抑制时，LDLR-/-小鼠体内AS病变减少，NK细胞可能有致AS的作用。,Arterioscler Thromb Vasc Biol.2004;24:1049-1054.Depletion of Natural Killer Cell Function Decreases Atherosclerosis in Low-Density Lipoprotein Receptor Null Mice,2005-8-15,41,五、AS与抗原呈递细胞,APC在连接天然免疫和获得性免疫中起桥梁作用，它能摄取、加工、处理抗原并将抗原信息呈递
23、给淋巴细胞，促使特异性淋巴细胞活化，产生获得性免疫应答。巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞是专职抗原呈递细胞，内皮细胞、成纤维细胞、上皮及间皮细胞等抗原呈递作用较弱，为非专职性抗原呈递细胞。,2005-8-15,42,获得性免疫应答需要双信号启动，即特异性抗原的刺激和来自抗原递呈细胞的共刺激信号，这些信号多要APC 特别走DC提供。APC通过其PRR的模式识别作用内在化病原体，并将其加工成MHC：肽复合物，之后递呈给Th细胞，并且只有在将某一物质识别为有害物后才表达共刺激信号7分子。,2005-8-15,43,人和鼠AS斑块均可检测到DC，并且DC与T淋巴细胞同时存在于易破裂的斑块肩部。DC还可
24、能通过抗原呈递作用刺激T淋巴细胞活化，影响斑块的稳定性。DC在摄取微环境中的抗原后进一步分化成熟，促进 T淋巴细胞活化，激活获得性免疫反应。,J Pathol.2002 Dec;198(4):511-6.Human atherosclerotic plaques express DC-SIGN,a novel protein found on dendritic cells and macrophages.,2005-8-15,44,六、AS与获得性免疫,2005-8-15,45,Zhou等将apoE-/-鼠与scid/scid免疫缺陷小鼠杂交其后代小鼠大动脉斑块面积与apoE-/-鼠相比减少
25、73，而将apoE-/-鼠CD4T细胞移植到apoE-/-/scid/scid小鼠体内，斑块增加164。,Circulation.2000;102:2919-2922.Transfer of CD41 T Cells Aggravates Atherosclerosis in Immunodeficient Apolipoprotein E Knockout Mice,2005-8-15,46,七、AS临床事件与免疫反应,免疫细胞在斑块部位的聚集，提示免疫在AS发展和转归中起作用。Yuri 发现，NKT细胞和DC在AS斑块肩部聚集，CD1+NKT细胞参与AS斑块的破裂，推测NKT细胞和DC间存
26、在直接的联系，共同参与AS斑块破裂过程。,J Histochem Cytochem.2005 Jun;53(6):781-5.Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques.,2005-8-15,47,而INF-抑制胶原合成，抑制SMCs增殖，还可以与TNF-和IL-1一起促进SMCs凋亡，使纤维帽变薄，易于破裂。免疫介质可通过调节基质金属蛋白酶、组织蛋白酶和肥大细胞蛋白水解酶可降解纤维帽胶原的释
27、放影响斑块的稳定。,2005-8-15,48,人AS晚期病变中T细胞数量占细胞总数的10到20，同时表达CD3、CD4和T细胞抗原受体（TCR+）的T细胞占所有CD3+T细胞的比例高达2/3（在apoE-/-鼠中可超过90）。AS的大部分临床并发症都涉及血栓形成，T细胞在AS斑块破裂处聚集可引发致命性的动脉粥样血栓形成。先天性免疫介质可影响血栓形成的一些环节，组织因子（TF）是动脉粥样血栓形成的主要因子，LPS、TNF-、IL-1、INF-和PTX-3都可诱导人ECs表达TF，CD40L可诱导单核巨噬细胞表达TF。,2005-8-15,49,而在动脉粥样瘤内M、Ecs、SMCs和活化的血小板都
28、可以表达CD40L42。可溶性细胞因子如IL-1和TNF-可改变纤维酶原激活物的活性，也可改变凝血调节因子及凝血抑制物的活性。免疫细胞因子增加内源性纤维酶原激活物抑制物的表达。,2005-8-15,50,八、问题与展望,病原体所特有的PAMPs被TKRs识别后可诱导活性氧中间物(ROI)和活性氮中间物(RNI)的产生、促炎因子的释放并上调共刺激分子的表达,随后启动获得性免疫。从而有利于病原体的清除。PAMPs可作为一种天然佐剂应用于感染性疾病的治疗，为PAMPs作为一种新型佐剂在抗感染、抗癌疫苗的制备中提供新的思路。,2005-8-15,51,实验证明HSP肽复合物的抗原性来自于多肽,而非HS
29、P本身。HSP 肽复合物能够引起MHC1类分子限制的CTL应答。用HSP 肽复合物免疫接种引起强有力的抗肿瘤、抗病毒和抗寄生虫效应。HSP 肽复合物可在体外组装,免疫接种量非常小(几百皮克)。由于HSPs是非多态性的，自感染细胞中产生的 肽复合物可直接针对细胞内的全部抗原,能够减少或消除突变体逃逸的可能性。,2005-8-15,52,人工合成的含有CpG基序的寡核苷酸可以通过改变碱基的序列、长度、CpG基序的位置和数目来调节其诱导的细胞因子类型。AS免疫机制观点的提出为的防治提供了新思路。免疫调节剂、抗生素在防治中的作用已受到关注,他汀类及阿司匹林抗炎、调节免疫作用正在得到验证。,2005-8
30、-15,53,2GpI是动脉粥样硬化发展过程中一种重要的免疫原。采用口服给予LDLR-/-小鼠2GpI，造成免疫耐受，发现小鼠早期AS斑块面积减少，病变处IL-4、IL-10表达上调。2GpI免疫耐受状态下的LDLR-/-小鼠还可以降低免疫系统对oxLDL的反应。,2005-8-15,54,总之，动脉粥样硬化免疫机制的研究尽管有较大进展，但还很不成熟。一些必需确定的基本事实还未能取得一致的结果，同时也缺少足够的人群研究资料的支持，以致一些重要的观点尚未获得共识。尽管如此，加强动脉粥样硬化免疫机制的研究，确定动脉粥样硬化的免疫学性质，尤其探索天然免疫在动脉粥样硬化发生早期的作用，仍是一个不可懈怠的研究领域。,2005-8-15,55,谢谢！,
