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1、遗传信息的传递,第三篇,中心法则(The Central Dogma),转 录,翻 译,逆转录,复 制,DNA,RNA,蛋白质,除了某些以RNA为基因组的RNA病毒外，基因通常是指染色体或基因组的一段DNA序列。基因包括编码序列（外显子）、调控序列和间隔序列（内含子）。,基因（gene）：编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的、负载遗传信息的基本单位。,基因组（genome）：一个生物体内所有遗传信息的总和。,人类基因组包含了细胞核染色体DNA（常染色体和性染色体）及线粒体DNA所携带的所有遗传物质。,第十四章,DNA的生物合成DNA Biosynthesis(Replication),复制(
2、replication)是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。,DNA复制的基本特征Basic Rules of DNA Replication,第 一 节,半保留复制(semi-conservative replication)双向复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-discontinuous replication),DNA复制的主要特征,一、DNA以半保留方式进行复制,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(t
3、emplate)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念:,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留 半保留式 混合式,密度梯度实验:,实验结果支持半保留复制的设想。,含15N-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义:,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,AGGTACTGCCACT
4、GG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。,二、DNA复制从起点向两个方向延伸,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),真核生物每
5、个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,三、DNA复制反应呈半不连续特征,领头链(leading strand),后随链(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leading strand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链(lagging strand)。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,
6、DNA复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,The Enzymology and Topology of DNA Replication,参与DNA复制的物质:,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol；模板(template):解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,RNA引物,RNA引物,子代DNA,聚合反应的特点:,DNA 新链生成需RNA引物和模板；新链的延长只
7、可沿5 3方向进行。,一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：,1.53 的聚合活性2.核酸外切酶活性,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的 DNA片段;切除引物,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,（一）原核生物有3种DNA聚合酶,个核心酶1个-复合物（、6种亚基）1对-亚基（可滑动的DNA夹子）,DNA聚合酶全酶结构,全酶结构包括：,亚基（130 000）主要功能是合成DNA亚基具有35外切酶活性（复制保真性所必需）亚基可增强其活性亚基可
8、能起组装作用,核心酶由、和亚基组成：,两侧的亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用,2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。,功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用,-复合物由6种亚基组成：、,功能：,DNA-pol（109kD）,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA
9、，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制(应急修复)。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,真核生物的DNA聚合酶,二、DNA聚合酶的碱基选择和校
10、对功能实现复制的保真性,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。,此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。,遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时有即时校对功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：,（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择,利用“错配”实验发现，DNA pol 对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能。DNA pol 对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。,（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的
11、酶，外切酶是有方向性的。,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。,DNA pol 的校读功能,三、复制中的解链伴有DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,E.Coli 基因图,解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶。单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SS
12、B)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态,复制过程正超螺旋的形成：,解链过程中正超螺旋的形成,既能水解、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶 拓扑异构酶,拓扑异构酶分类：,拓扑异构酶作用特点：,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制：,拓扑酶的作用方式：,四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P
13、末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶的作用：,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,DNA聚合酶、拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,原核生物DNA复制过程The Process of DNA Replication in Prokaryotes,第 三 节,起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配
14、引发体，形成复制叉并合成RNA引物。,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,一、复制的起始,E.coli复制起始点 oriC,（一）DNA的解链,原核生物的复制起始部位及解链,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,（二）引物合成和引发体形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,引发体和复制叉的生成,二、DNA链的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的
15、方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。,后随链的合成,在复制叉同时合成前导链和后随链,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,三、复制的终止,子链中的RNA引物被取代,真核生物DNA生物合成过程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes,第 四 节,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H
16、和FEN1等。,真核生物与原核生物DNA复制的差异：,逆转录和其他复制方式Reverse Transcription&Other DNA Replication Ways,第五节,双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是RNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),逆转录酶,一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制,RNA,DNA,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,RNA病毒在细胞内复制成双链DN
17、A的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA,逆转录酶催化的cDNA合成,二、逆转录的发现发展了中心法则,逆转录酶和逆转
18、录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,三、真核生物线粒体DNA按D环方式复制,D-环复制时需合成引物。mtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别。,
