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1、1,第十四章 RNA的生物合成,转录转录后加工RNA的复制,南通大学医学院生化 殷冬梅,2,3,mRNA:信使RNA,指导蛋白质生物合成的直接模板,tRNA：转运RNA，蛋白质生物合成中的接合器,rRNA：核蛋白体RNA，含量最多，蛋白质合成器,U-尿嘧啶 取代 T-胸腺嘧啶,(hnRNA:不均一核RNA,mRNA 的原初转录产物),小RNA:snRNA和miRNA，参与RNA的剪接 和基因表达调控,4,生物体以DNA为模板，以四种核糖核苷酸为原料，在RNA聚合酶 催化下合成RNA的过程称为转录。,第一节 DNA指导下的RNA合成-转录体系,转录(transcription),与复制有哪些相似
2、之处？(回顾：模板、酶、键、方向、规律),5,模板原料酶产物配对,两股链均复制（半保留复制）dNTP（脱氧核苷酸）DNA聚合酶子代双链DNA A-T,G-C,模板链转录(不对称转录)NTP（核苷酸）RNA聚合酶mRNA,tRNA,rRNAA-U,T-A,G-C,复制,转录,复制与转录的区别,引物 需要 不需要,6,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,RNA 是目前已知的唯一具有储存，传递遗传信息，催化（核酶）三重功能的生物大分子,7,一、RNA聚合酶RNA polymerase
3、,DDRP,8,(依赖DNA的RNA聚合酶）,(一)RNA聚合酶（RNA-pol),U,9,10,U,11,12,1.原核生物的RNA聚合酶,一种多亚基组成的多聚蛋白酶（465kDa）,13,核心酶,（2）,催化三种RNA延长,因子,识别转录起始位点,全酶:,（五聚体蛋白质）,（起始亚基）,RNA-pol 的转录速度：(在37时)约50个核苷酸/s 肽链合成速度15个AA/s,14,15,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,16,2,真核生物的RNA聚合酶,(1)分类:RNA聚合酶 I、II、III,II 转录 mRNA前体，snRNA,III 转录 tRNA,5S rRNA,snRNA,sc
4、RNA,17,(2)用-鹅膏蕈碱区别三类真核生物RNA,RNA聚合酶 I:不敏感。位于核仁，催化生成45SrRNA II：敏感，催化生成mRNA前体和核内小RNA III：中等敏感，催化tRNA，5S rRNA和 胞质小RNA,(3)真核生物RNA-pol是借助各种转录因子 识别启动子转录（无原核生物RNA-pol)（4）RNA聚合酶 II 最大亚基的羧基末端有一段共有序列：Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser,称为羧基末端结构域（CTD）是维持细胞活性所必需。,线粒体的 RNA-pol(Mt 型)可被利福平抑制(类似细菌RNA-pol）不受-鹅膏蕈碱影响。,18,（二）转录
5、模板,DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA 的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作负链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为正链或Crick链。在体内DNA双链中仅一条用于转录。在庞大的细胞基因组中，有时间、空间特异性，只有部分基因发生转录，且为“不对称转录”,DNA分子上转录出RNA的区段称为 结构基因(structural gene)。,19,转录模板,模板链(负链),template strand,编码链(正链),coding strand,20,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t c a t g
6、t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,21,不对称转录(asymmetric transcription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录,细胞按不同发育时序、生存条件和生理需要，只有部分基因发生转录。能转录出RNA的 DNA区段称结构基因。转录的这种选择性称 为不对称转录 p264。,模板链并非永远在同一条单链上。,22,5,基因组DNA,基因1,基因2,基因3,转录,RNA,RNA,RNA,不对称转录,3,5,3,23,模板上酶的辨认、结合区,35,原核
7、生物的一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,转录始于DNA的一定区域，RNA聚合酶首先识别DNA模板上的转录起始部位 启动子（promoter)，是RNA聚合酶识别、结合开始转录的一段DNA序列。,（一）启动子,24,RNA聚合酶保护法,25,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognition site),26,模板DNA中与转
8、录有关的结构,1,启动子:(promoter),转录开始时RNA聚合酶识别、结合和起始的一段DNA序列。,原核生物启动子：,RNA聚合酶识别部位(上游-35位处)结合部位(上游-10位处,TATA盒序列)转录起始点:开始转录的作用位点（1）,结构组成:(三个功能部位),27,28,29,真核生物启动子:由转录因子而不是RNA聚合酶所识别,组成:一些短的保守序列-各种顺式作用元件组合,a.在转录起始前-25bp区段多有典型的TATA 序列（TATA box)-共有序列b.-70bp处有CAAT区，另外还有GC盒等,识别:转录因子p266-反式作用因子,30,顺式作用元件:具有可影响（调控）转录的
9、各种DNA序列组分,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,1,（Hogness盒）,约200bp,转录的起始点往往不是翻译起始点，转录产物序列分析表明，其5 端 13 位往往不是AUG起始密码子，AUG起始密码子多在转录起始点稍后才出现。,31,区别与原核生物的转录起始：真核生物启动子由转录因子而不是RNA聚合酶识别。,转录因子：一些蛋白质因子可直接或间接结合RNA聚合酶，通过识别DNA序列中的顺式作用元件而调节启动转录。,与RNA-pol II 转录的启动有关的转录因子 通用因子 上游因子 可诱导因子,32,（二）终止子(terminator),提供转录停止信号的
10、DNA或RNA序列称为终止子.,两类终止子,不依赖rho终止子,富含GC的回文及 3-端系列U结构转录生成的RNA有茎环状结构,依赖rho终止子,Rho因子:46kDa 的蛋白质,六聚体形式存在.有NTP酶及 解旋酶活性。,原核生物终止子：,33,原核生物的两类终止子,富含GC的回文及 3-端系列U结构,不含GC的回文及系列U结构,形成茎环状的发夹结构A-U配对不稳定，解离RNA,34,二 转录过程,三个阶段：,模板的识别及转录的起始转录的延长转录的终止,特点：需要DNA模板，不需要引物，从头开始,35,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：DNA双链局部解开，使其中的一条链作为转录的模板。
11、（10-20个核苷酸对，形成转录空泡）RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。,36,2.DNA双链解开:-10bp区Pribnow box 双链解开,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,转录的起始生成起始复合物,1、原核生物的转录起始,（第一位）,（第二位）,4.第一个磷酸二酯键形成后亚基从转录起始复合物上脱落,37,编码链,模板链,RNA-DNA杂交链,转录空泡,RNApol（2）-D
12、NA-pppGpN-OH3,转录起始复合物：,双链重新形成,pppGpN-,5,3,磷酸二酯键,38,(二)转录延长,原核生物与真核生物无太多区别，仅RNA-pol不同,反应通式,39,1、原核生物的转录延长,因子脱落,核心酶构象改变,RNA-pol迅速前移,依次加入NP,1、如何延长,RNA延长,40,2、形成转录复合物（转录空泡）：复合物：RNA-pol（核心酶）-DNA模板-RNA产物,转录空泡(transcription bubble）,RNA-pol（核心酶）,41,碱基互补，合成方向为5 3 RNA-pol催化核苷酸之间以磷酸二酯键相连生成长约12bp的RAN/DNA 疏松的杂化双
13、链,42,依赖Rho()因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类：,1、原核生物的转录终止,43,rho因子:46kDa 的蛋白质,六聚体形式存在.有ATP酶及解旋酶活性,44,作用机制：rho 因子具有ATP酶活性和解螺旋酶活性，与RNA转录产物结合，导致rho 因子与RNA-pol的构象变化，RNA-pol停顿，使RNA从转录复合物中释放。,（1）依赖 rho 因子的转录终止,45,（2）非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的
14、结构来终止转录。,RNA终止区域富含GC重复序列，新生RNA链易形成发夹结构，阻止RNA-pol移动；polyU与模板A的氢键很弱，A-U配对最不稳定，提供信号使RNA聚合酶脱离模板。,46,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,UUUU.,UUUU.,5UUG
15、CAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,47,非依赖 rho 因子的终止:,48,原核生物（依赖rho的终止）的转录全过程,49,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,RNA,RNA聚合酶,50,二、真核生物的转录过程,转录起始部位,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，而需依靠众多的转录因子。RNA聚合酶的基本启动子起始点上游多数有共同的5TATA序列(Hogness 盒），其位置不如原核生物上游-35和-1
16、0区典型。,51,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,DNA分子上具有的可影响(调控)转录的各种区域,52,转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors,TF)。相应于RNA-pol I,II,III的TF分别称为TF
17、I,TFII,TFIII。,53,转录起始前复合物(pre-initiation complex,PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子（TF），TF由若干结构域。在众多的TFII中仅TFIID为目前已知的唯一能结合TATA盒的蛋白质。,54,转录因子和转录起始复合物,1、RNA-pol 借助TF（A、B、C、D、E、F）与DNA结合,2、形成 起始前复合物（PIC）,TF之间相互结合，其中 TFD 先与 TATA 盒结合,RNA-pol加入形成 PIC,TFD是目前已知唯一能识别和结合TATA盒的蛋白质（也称TATA结合蛋白）,55,56,TATA,A
18、,D,B,E,F,转录起始前复合物(PIC),RNA-pol II,DNA,大多数TF II或其亚基的氨基酸序列与原核生物因子由一致性。,57,重要名词,58,2、真核生物的转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,59,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,60,2、真核生物的转录终止,1、与转录后修饰密切相关,转录终止修饰点AATAAAGTGT,、加入3 polyA尾巴及5 帽子结构,、修饰点后产物被降
19、解,61,终止修饰点：3端后常有一组共同序列AATAAA,加上许多 的GT序列,62,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,真核生物转录终止,和转录后修饰密切相关。,63,RNA转录过程-RNA合成,基因组DNA,RNA聚合酶,核心酶,因子,识别位点,结合位点,因子重新使用,终止区,mRNA,文字说明,模板链,编码链,64,第三节RNA的转录后加工,原核生物中RNA的加工,真核生物中RNA的加工,无活性的原初转录产物需经一系列的加工修饰。包括：RNA
20、的裂解，5端与3端的切除、和特殊结构的形成、核苷的修饰以及拼接和编辑等过程，才能转变成成熟的 RNA。,65,一、原核生物中RNA的加工,(3)mRNA前体的加工:原核生物mRNA转录后无需加工，可以直接用于蛋白质 的翻译，可以边转录边翻译。,rRNA前体的加工:甲基化修饰16S rRNA含10个甲基;23S rRNA含约20个甲基,(2)tRNA前体的加工:酶切修饰*核酸内切酶切 tRNA 的两端切断*核酸外切酶逐个切3-端附加顺序修剪*在tRNA 3-端加-CCAOH*核苷酸修饰和异构化,66,二、真核生物中RNA的加工,(一)rRNA的转录后加工,1,甲基化程度比原核生物高,是snRNA
21、指 导的加工过程.,2,有的 rRNA 具有核酶的作用.即自我剪接.,67,rRNA的转录后加工,68,(二)、tRNA的转录后加工,69,tRNA的转录后加工,tRNA前体,70,71,tRNA核苷酰转移酶、连接酶,ATP,ADP,72,碱基修饰,73,(三)真核生物mRNA前体的一般加工,真核生物基因特点：,1、单顺反子，存在居间序列（内含子），与 编码序列（外显子）一起转录2、转录在核内，翻译在胞浆中。mRNA经加工 并转移至胞浆中才表现翻译功能3，核内不均一RNA（hnRNA)和DNA模板链完 全相同,74,mRNA的加工过程：,5端形成帽子结构,3端加polyA尾巴,mRNA的剪接,
22、核苷的甲基化作用,RNA的编辑（RNA editing）,75,1、mRNA转录后加工-帽结构的形成,鸟苷酸转移酶,GTP,PPi,76,帽子结构,m7Gppp帽子,rho 因子的,77,2、3-polyA尾结构的生成,hnRNA,78,mRNA首尾修饰的意义：,79,3、mRNA的剪接,（1）hnRNA 和 snRNA,核内的初级mRNA称为杂化核RNA(hetero-nuclear RNA,hnRNA)（核内不均一RNA）编码蛋白质的基因含数目巨大的内含子，存在GT-AG规则内含子5GT，3AGsnRNA(small nuclear RNA)：100-300bp,剪接体splicesome
23、参与hnRNA的拼接,是mRNA剪接的场所,80,剪接过程的二次转酯反应（GU-AG规则）：1、由含pG-OH的酶断裂外显子1和内含子之间的磷酸二酯键，游离出外显子1的3OH2、由断裂出的外显子1的3OH断裂内含子与外显子2之间的磷酸二酯键，外显子1取代内含子,第一次,第二次,81,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,（2）断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,82,、外显子(exon)和内含子(intron),外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表
24、达为成熟RNA的核酸序列。内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,83,84,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,剪接体,snRNA参与,85,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,86,3.mRNA的剪接,胰岛素基因的转录、翻译,断裂基因,87,第三节RNA指导的RNA合成RNA的复制,RNA复制酶：RNA指导的RNA聚合酶特点：以病毒RNA为模板，合成与模板相同的RNA 该复制产物感染细胞，产生正常的RNA病毒。病毒的全部遗传信息（病毒外壳蛋白、各种酶）均贮存在RNA中,88,病
25、毒的种类：病毒含有正链RNA：首先合成有关蛋白（含复制酶）再进行病毒RNA复制，如灰质炎病毒 病毒含有负链RNA和复制酶：先合成正链RNA，再以此为模板合成病毒蛋白质和复制病毒RNA，如狂犬病病毒病毒含有双链RNA和复制酶：先合成正链RNA并以此为模板翻译病毒蛋白质致癌RNA病毒：需经过DNA前病毒阶段，由反转录酶催化,89,90,1原核生物RNA聚合酶中辨认转录起始点的亚基是：A.亚基 B.亚基 C.亚基 D.因子 E.因子,2RNA的不对称转录是指 A.同一单链DNA模板的不同片段转录时可以交替作有意义链和反义链B.同一DNA 模板的转录可以 从53延长，也可以从35延长C.一条DNA单链
26、模板转录出的RNA片段长，另一条DNA单链模板转录出的 RNA片段短 D.转录经翻译生成氨基酸，在氨基酸中含有不对称碳原子E.没有任何规律性的转录过程,复习题,91,3大肠杆菌的RNA聚合酶由几个亚基组成，其核心酶的组成是：A.B.C.D.,4能特异性抑制原核生物RNA聚合酶的是：A.鹅膏蕈碱 B.亚硝酸盐 C.利福平D.放线菌酮 E.四环素,5tRNA和5s rRNA是由真核生物哪种酶催化转录产生的？A.RNA聚合酶 B.RNA聚合酶 C.RNA聚合酶D.RNA聚合酶核心酶 E.逆转录酶,92,6下列关于RNA聚合酶和DNA聚合酶的叙述正确的是：A.都需要引物RNAB.都利用核苷二磷酸合成多
27、核苷酸链C.DNA聚合酶以DNA为模板合成DNAD.RAN聚合酶以RNA为模板合成RNAE.两种聚合酶都可以合成DNA,7Pribnow box序列是指：A.AATAAT B.AAUAAA C.TATAAT D.TTGACA E.TAAGCG,93,8真核生物的TATA盒是：A.DNA合成的起始位点 B.RNA聚合酶与DNA模板的结合位点C.RNA聚合酶与DNA模板的识别位点D.转录起始点 E.转录终止位点,9转录产物RNA的5端最常见的起始核苷酸是：A.A或U B.C或G C.pppG或pppA D.pppC或pppU E.无规律,10真核生物中辨认TATA盒的转录因子是：A.TFA B.T
28、FB C.TFDD.TFE E.TFF,94,11原核生物非依赖Rho因子的转录终止方式是：A.形成终止复合物 B.形成终止空泡C.形成发夹结构 D.形成polyA的尾巴E.形成三叶草的结构,12AATAAA是：A.真核生物启动子的辨认序列 B.真核生物转录终止修饰点C.真核生物mRNA的polyA的尾巴结构D.真核生物的顺式作用元件E.真核生物的反式作用因子,95,13以下过程出现在转录后加工的是：A.连接酶连接断裂的DNA单链B.转录因子结合DNA模板C.切除初级mRNA中的内含子D.切除初级tRNA中的稀有碱基E.RNA聚合酶沿DNA链移动,96,【名词解释】1 不对称转录 2.编码链 3.RNA聚合酶的核心酶4.转录起始前复合（PIC）5.Rho因子 6.hnRNA 7 外显子 8.内含子,1.原核生物转录起始的-35区和-10区序列分别是什么，有何作用？,2.原核生物有哪两种终止转录的方式？简述两种终止的过程。,3.什么是真核生物的转录终止的修饰点？真核生物mRNA的转录终止和转录后修饰有什么关系？,4.复制和转录过程有何异同点？,【问答题】,
