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1、选修三 现代生物科技专题 专题一 基因工程,第一小节 DNA重组技术的基本工具,The camelecow,为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上并成功表达？,1、大多数生物的遗传物质都是DNA，且主要为双螺旋结构，即不同生物的DNA分子基本结构是相同的，都遵循碱基互补配对原则。所以不同的生物DNA可以嫁接 2、地球上的所有生物共用一套遗传密码，所以，一种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达,基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,原理：,操作水平
2、：,结果(目的）：,基因重组,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。,（一）基因工程的概念,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,（一）基因工程的概念,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,重组DNA,导入,形成,（一）基因工程的概念,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出抗虫基因,关键步骤二：,形成重组DNA,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,（二）DNA重组技术的基本工具,关键步骤一的
3、工具：,关键步骤二的工具：,关键步骤三的工具：,分子手术刀限制性内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车运载体,阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶分子手术刀”的相关内容，填写下表,自主学习,主要从原核生物中分离纯化而来,已经分离出大约4000种,1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,2、使每一条链中特定部位的特定两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,形成两种末端：黏性末端或平末端,G,A,3,5-磷酸二酯键,磷酸二酯键,（一）限制酶“分子手术刀”,中轴线,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,EcoRI限制酶的作用,“分子手术刀”
4、限制性核酸内切酶,（二）基因操作的工具,限制酶,什么叫黏性末端？,（二）基因操作的工具,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,EcoR,中轴线,Sma,黏性末端,平末 端平末端,黏性末端,18,仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？,限制酶的识别序列,限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对
5、称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列,目的基因所在的DNA分子,Sma识别序列及切割的位点为CCCGGGEcoR识别序列及切割的位点GAATTC,请选择合适的限制酶切割目的基因,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,（二）基因操作的工具,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识
6、别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。（1）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？,可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）,小试身手,1下图所示限制性核酸内切酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制性核酸内切酶能识别的碱基序列及切点是(),ACTTAAG，切点在C和T之间BCTTAAG，切点在G和A之间CGAATTC，切点在G和A之间DCTTAAG，切点在C和T之间,C,
7、2.下列关于限制酶的说法正确的是 A限制酶广泛存在于各种生物中，但原核生物 中很少B一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键,B,24,类型,来源,功能,相同点,差别,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),阅读课本第5页“分子缝合针”DNA连接酶的相关内容，填写下表,自主学习,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键,DNA连接酶的作用,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
8、,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,A A T T G,C,A,A,T,T,A,A,T,T,DNA聚合酶的作用,返回,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,
9、4据下图所示，有关工具酶功能的叙述错误的是(),A限制性核酸内切酶可以切断a处BDNA聚合酶可以连接a处C解旋酶可以使b处解开DDNA连接酶可以连接c处,D,？,目的基因,受体细胞,运载体,问：运载体具备什么特点才能完成此操作？,基因很难进入受体细胞中。,运载体的作用：将外源基因送入受体细胞。,运载体的特点1：,能进入并在宿主细胞内稳定保存并大量复制；,问题1：假如目的基因导入受体细胞后 不能复制将怎样？,问题2：作为载体没有切割位点将怎样？,？,重组质粒,DNA连接酶,受体细胞,运载体的特点2：,相同限制酶,CTTAA,G,CTTAA,G,目的基因,具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。,目
10、的基因所在片段,CTTAA,G,CTTAA,G,CTTAA,CTTAA,G,G,PSt,问题3：目的基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？,有标记基因，以便于鉴定与选择 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,运载体的特点3：,问题4：如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离会怎样？,运载体的特点4：,对受体细胞无害、易分离。,常用的运载体：质粒、动植物病毒，噬菌体衍生物,细菌的质粒：自主复制的双链、闭合、环状DNA分子；,可以在细胞间转移,pBR322质粒结构,标记基因,进行筛选,限制性内切酶,识别序列,外源基因连接,质粒的特点,1 细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状D
11、NA分子；2 质粒的存在对宿主细胞无影响；3.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,1.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键,C,练习,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3.有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细
12、胞 D、质粒都可作为运载体,B D,练习,1下列关于DNA连接酶的叙述中，正确的是 ADNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢 键BDNA连接酶连接的是黏性末端两条链主链上 的磷酸和脱氧核糖CDNA连接酶连接的是黏性末端两条链主链上 的磷酸和核糖D同一种DNA连接酶可以切出不同的黏性末端,B,A,2在胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的 同一种限制酶切割两者；不需同一种限制酶切割两者；加入适量的DNA连接酶；不需加DNA连接酶A B C D,3.下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是 A B C D,答案：D,4、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是
13、一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中,答案：C,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,寻根问底,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其D
14、NA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,3、天然的DNA分子可以直接用做 基因工程载体吗？为什么？,提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因
15、插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,再见,
