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1、,第13章 DNA的生物合成复制（Replication）,本章主要内容：中心法则,DNA复制的半保留性参与DNA复制的酶类和蛋白因子,DNA的复制过程 DNA的损伤和修复 反转录,现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点-在生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位，而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。,从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。,1.中心法则,2.DNA的半保留复制,半保留复制(semiconservative replication)：复制时，亲代的双链DNA解开成两条单,链，然后各自作为模板指导合成新的互补链。,所形成的两个子代DNA分子与亲代DNA
2、分子碱基顺序完全相同复制。每个子代DNA,分子中的一条链来自亲代，另一条链为新合成,的半保留。,2.DNA的半保留复制,半保留复制实验依据,1958年M.Messelson 等用实验加以证实,双螺旋结构是半保留复制的分子基础,半保留复制的意义,复制,的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性。,复制,DNA的生物合成,逆转录,复制（replication）：即DNA的生物合,成，以亲代DNA为模板合成两个完全相同的子代DNA分子的过程。,复制的反应d ATP,d CTPd GTPd TTP,DNA聚合酶DNA模板,DNA+（n1+n2+n3+n4)PPi,PPi随即
3、被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。DNA 复制是在酶的催化下的脱氧核苷酸聚合过程。需要4种dNTP为底物外，还需要多种酶、蛋白因子、亲代DNA单链模板及RNA引物。,3.DNA的复制过程,3.1 与复制有关的酶和因子原核生物：以大肠杆菌为例,1.原料：4种dNTP,2.解开成单链的DNA模板,3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游,离的 3-OH。,4.引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA,引物,5.DnaA蛋白，与复制起始部位上（Ori C）,特定的序列结合。,E.Coli上固定的复制起始点称为 Ori.C,6.DnaB（解螺旋酶
4、helicase，rep 蛋白）：由多种蛋白因子协助在复制的起始点上解开双螺旋。,7.单链结合蛋白（SSB，single strandedbinding protein）：稳定已经解开成两股的DNA单链，防止其退火复性。,8.拓扑异构酶（DNA,topoisomerase）,拓扑一词的含义是指物体或,图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。,DNA 分子中存在打结，缠绕、,连环的现象。拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。,I 型酶,II 型酶,DNA拓扑异构酶,（DNA,topoiSOmerase）,10,8,局部解链后,9.DNA聚合酶（DNA pol
5、ymerase）,全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-,dependent DNA polymerase,DNA-pol或DDDP）,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,原核生物的DNA聚合酶：,聚合酶 I：用于切除引物RNA,并填补留下的空隙,53 聚合酶活性，延伸多核苷酸链,35 外切酶的作用，切除可能错配的核苷酸53 外切酶的作用是切除引物,小片段,323个氨基酸5 核酸外切酶活性,大片段,/Klenow 片段,604个氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,木瓜蛋白酶,聚合酶II：活性弱,53 聚合酶活性，延伸多核苷酸链3 5 核酸外切酶活性,聚合酶
6、III：主要的复制酶，并有校读、纠错,的功能,53 聚合酶活性，延伸多核苷酸链，活性很强，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料 dNTP与游离的3-OH上连接，同时释出一个PPi。35 核酸外切酶活性，切除可能错配的,核苷酸,DNA-pol III:,由10种亚基组成的不对称聚合体,催化效率最高其中亚基具有,53聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而亚基具有35外,切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。,负责链的延长(活性高),切去引物物RNA，补上正确的的DNA片段与修复有关(活性低),DNA聚合酶DNA聚合酶,原核生,物 DNA聚合酶,53,35,核酸
7、外切 核酸外切,聚合,功 能,DNA聚合酶 53,大肠杆菌3种DNA聚合酶的性质比较催化活性,真核生物的DNA聚合酶,在复制延长中起催化作用在没有其他DNA-pol时才发挥催化作用在线粒体DNA复制中起催化作用在复制延长中起催化作用在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用,DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol,10.DNA连接酶（ligase）,将不连续的DNA片段以磷酸二酯键连接起来，原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATP,S,M,哺乳动物的细胞周期,DNA合成(synthesis)期,G1分,为,起始、延长、终止三个阶段
8、,3.DNA的复制过程G2,聚合反应的特点：,1、聚合反应具有方向性:5 3,2、DNA 聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸,聚合，只能在一段寡核苷酸的 3-OH 逐个,添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。,3.DNA的复制过程,DNA聚合酶延伸多核苷酸链总是53方向,聚合酶催化的链延长反应,相关的几个概念：,1、复制起始点（E.coli-OriC）,复制从特定的位点开始，这一位置叫复制原点。原核生物的DNA上一般只有一个复制原点，但在,迅速生长时期，第一轮复制尚未完成，就在起点处启动第二轮复制。,真核生物则有多个复制原点，可以同时启动复制,过程。,53,新链,353,2、复制叉（replic
9、ation fork）复制时DNA双链解开分成二股单链，新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种 Y字形的结构称为复制叉。5,35,亲代DNA复制方向,A,放射自显影图像,ori,ori,ori,复制示意,B图,形,3、双向复制原核生物例如E.coli，是从固定的复制起始点开始，同时向两个方向进行复制，称为双向复制。,复制起始点,真核,原核复制叉,3.DNA的复制过程3.2 DNA复制过程3.2.1 复制的起始,需要解决两个问题：,1、DNA解开成单链，提供模板,2、合成引物，提供3-OH 末端,DnaA蛋白辨认起始点,形成起始复合物,DnaB蛋白解螺旋,DnaC蛋白协助DnaB,在多种蛋
10、白质参与下，DNA双螺旋解开，形成单链,SSB维持单链稳定,OH,合成引物,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,53,3,5,总结：,复制的起始在原核生物只有一个起始点（Ori.C），而在真核生物有多个起始点。,DnaA，DnaB（解螺旋酶，rep蛋白）和DnaC参与解,链，形成复制叉（replication fork），SSB结合并稳定解开的单股DNA链；引物酶（DnaG）与上述因子、酶构成引发体（primosome），并合成RNA引物。解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为负超螺旋。,辨认,功能起始点并结合于位点解开DNA双链协
11、助解螺旋酶催化RNA引物生成稳定解开的单链理顺DNA链E.coli的复制起始点,名称DnaA蛋白(四聚体)解螺旋酶（DnaB蛋白，rep蛋白）DnaC蛋白引物酶（DnaG蛋白）SSB拓扑异构酶oriC（245bp的DNA组分）,参与复制起始的各种因子和酶,原核生物复制的起始,5,3,5,DNA-pol DNA-polDNA-polDNA-pol,dGTP,dTTP,dCTPdTTP,dATPdGTP,dATP,dCTP,3.2.2 DNA链的延伸DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合到新链3末端，使其不断延长。,半不连续复制示意图,这种前导链连续合成，随后链断续合成的,方式，称为半不连续复制。,
12、随后链中合成的多个DNA 片段，称为冈崎片 段。冈 崎 片 段 的 长 度 原 核 细 胞 中 约 1000-2000 个核苷酸，真核细胞中约100-200 个核苷,酸。,复制叉的推进,先导链的合成,引物酶在复制原点附近合成一段 RNA,引物；,DNA聚合酶(原核细胞)在引物的3末,端逐个添加脱氧核苷酸。,随着复制叉的推进，亲代DNA双螺旋不,断被解开，先导链也不断延伸。,随后链的合成,引物的合成：随后链的每个冈崎片段都需要合成RNA引物。也是由引物酶催化。,冈崎片段的合成：DNA聚合酶(原核细胞)在引物的3末端使DNA链延伸，直至抵达其下游的另一个冈崎片段的RNA引物的5端。,冈崎片段的连结
13、：DNA聚合酶一面以其DNA聚合活性在上游冈崎片段的 3-OH末端添加脱氧核苷酸，一面以其53核酸外切活性切除引物，直至将引物全部切除。DNA连接酶将最后的缺口补好。,先导链和随后链中DNA的延伸由同一个DNA聚合酶全酶二聚体催化,随后链的模板回折成环，从而使冈崎片段的延伸方,向与先导链的延伸方向一致，它们的3末端分别落在DNA聚合酶全酶的双活性部位。因此，随着聚合酶,的移动，两条链同时延伸。,复制叉的结构,由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来。,在真核生物，由端粒酶（telomerase）催,化在真核线性DNA的末段形成一种特殊的结构并与蛋白质结合成
14、端粒（telomere）。,3.2.3 复制的终止,连接酶将DNA片段连接起来完成复制,DNA聚合酶I正在一边切除RNA引物，一边合成新的DNA以填补空隙,引物,冈崎片段,大肠杆菌DNA的复制,至少依赖三种机制,1、遵守严格的碱基配对规律。聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求选择底物）。,2、复制出错时有即时的校读功能3、切除引物,4、聚合时的方向5、修复作用,复制忠实性的保证,聚合酶催化的链延长反应,胸腺嘧啶二聚体,DNA的突变有点突变（碱基的错配）、碱基的缺失、DNA片段的重排等形式。,4.DNA的损伤与修复4.1 DNA的损伤DNA的突变(损伤)大多数是自发的，是进化与分化的基
15、础。环境中的理化因素，如紫外辐射引起两个嘧啶碱基的共价聚合。许多化学诱变剂，它们常是致癌物,如亚硝酸盐，常导致DNA突变。,直接修复：如光复活酶,普遍存在在生物机体中,可以把嘧啶二,聚体恢复正常状态。,切除修复：找出损伤位置并切除，进行修复合成并连接。,重组修复：先复制再修复。子代链在对应模板链的损伤处留下缺口，先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口。,SOS系统：复杂的应急反应。既有避免差错的修复又有引起差,错的修复，后者有高变异率但也增加了生存机会。,4.DNA的损伤与修复,4.2 DNA损伤的修复,重组修复切除修复,逆转录酶(reverse transc
16、riptase),逆转录(reverse transcription),以RNA为模板，合成与其互补的,DNA的过程。,逆转录酶,依赖RNA的DNA聚合酶,5.逆转录作用以RNA为模板合成DNA,逆转录也称反转录，是某些生物（如鸡的肉瘤病毒、HIV等）的特殊复制方,式。它们的遗传信息载体是RNA,而不是DNA。因此，,在感染细胞时，首先经过逆转录作用成为双链DNA，才能整合到宿主基因组中去。这个过程由逆转录酶催化，它具有以RNA为模板合成DNA，水解杂交链上的RNA以及以DNA为模板合成DNA三种活性。逆转录现象和逆转录酶,（reverse,transcriptase）（H.,Temin，19
17、70）,是分子生物学研究中的重大发现，是对经典中心法则重,RNA,DNA,以RNA为模板，合成 DNA的过程。反转录酶,反转录酶有三个作用以RNA为模板合成 DNA(cDNA）水解RNA模板,第二,以新合成单链 DNA为模板合成条DNA,逆转录病毒细胞内的逆转录现象：RNA 模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA,*,逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同,样具有遗传物质的传代与表达功能。,AAAA,SI核酸酶,逆转录酶A AA AT T T T碱水解T T T TDNA聚合酶,分子生物学研究可应用逆转录酶，合成DNA以mRNA为模板，逆转录合成与 mRNA
18、碱基序列互补的DNA链，称为cDNA,complementary,DNA,RNA杂交双链,单链DNA,双链DNA,细,胞,中,试,管,内,聚合酶连锁反应,DNA,chain,（polymerasereaction,PCR,）,是一个温度和时间可以控制的反应体系含有双链DNA模板耐热的DNA聚合酶（如Taq酶）一对设计适当的 RNA引物，dNTP原料，并且过量经“变性-退火-延伸”多次循环使目的 DNA得以扩增,8.拓扑异构酶（DNA topoisomerase）,拓扑一词的含义是指物体或,图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。,DNA 分子中存在打结，,缠绕、连环的现象。,I 型酶：切开双链中的一股，使DNA不致打结，切口的3端可通过自由转动一周再与5端磷酸连接，不需ATP。,II 型酶：切断处于超螺旋状态中双股链中的某个部位，通过切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢复复制所要求的负超螺旋状态。,
