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1、1,实验 4 酶切重组质粒电泳分离所插入的DNA,2,目 的1鉴定。鉴定所培养的单菌落中是否含有重组质粒，或仅含有自身环化的质粒。当酶切产物电泳后，重组成功者电泳后会出现大小不等的两条DNA条带，一条为线性质粒载体的DNA，分子量大，在后面，另一条为插入的目的基因，分子量小，在前面；而自身环化者仅有一条载体的DNA条带。2收获。通过电泳分离，使载体与插入目的基因分开，便于分别回收载体和已大量扩增了的插入目的基因。比如探针用片段。,3,本实验由2个部分组成：（1）酶切重组质粒；（2）DNA的琼脂糖凝胶电泳。关于限制性内切酶本实验选用的限制性内切酶是分子生物学中最为常用的工具酶。通常不同的限制性内
2、切酶分别能识别一小段双链DNA序列，长度多在46个核苷酸，且呈双重对称的DNA序列，并将其切断。有粘端和钝端两种形式：,4,EcoR I 5.GAATTC.3 5.G AATTC.33.CTTAAG.5 3.CTTAA G.5 Pst I 5.CTGCAG.3 5.CTGCA G.33.GACGTC.5 3.G ACGTC.5 Sma I 5.CCCGGG.3 5.CCC GGG.33.GGGCCC.5 3.GGG CCC.5,5,利用这种特性，可以选择适当的酶来切割所需的DNA片段，或选择适当的酶切开载体，造成载体的粘端序列与插入DNA的粘端序列相同，以便于重组质粒。具体酶的特性、识别位点等
3、可以参考不同公司的试剂目录。,6,琼脂糖凝胶电泳DNA的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中使用广泛的技术，该技术利用DNA分子在电场下向电场一极迁徙的特性。在pH中性的条件下，DNA分子由阴极向阳极迁徙。其间，DNA分子量大，摩擦阻力大，在凝胶的孔隙中迁徙得慢；分子量小，摩擦阻力小，迁徙快，在电泳一定时间后，大小不等得DNA分子可以得到有效得分离。同样分子量的DNA，环状的较线性的迁徙速度快。分离的DNA可以方便地用溴乙锭染色，方法是：（1）在灌胶时直接把溴乙锭混入凝胶，或（2）电泳后将凝胶浸入溴乙锭染液（我们推荐前者），染色后在紫外透射灯下可以看到橘红色的DNA条带，在一般实验室最低分辨能力（
4、肉眼可见的）约为50100ng。,7,原 理采用限制性内切酶Hind III切开插入DNA与质粒载体，将这一反应液上样于琼脂糖凝胶，电泳，使分子量小的插入DNA前移，并与分子量大的在电泳中滞后的质粒载体DNA分开。,8,实验准备（参考教材）,9,实验步骤1酶切质粒取一洁净的1.5ml Eppendorf管，编好号，插入冰中，依次加入：水 7ul 10缓冲液 2ul BSA 2ul 重组质粒 8ul Hind III 1ul 20ul盖上盖，混匀，将反应物甩入管底，置37水浴中温育1小时。,10,2灌胶将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。取一烧杯，放入：琼脂糖 0
5、.7 g 5TBE 10 ml 水 40 ml 50 ml混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入5ul饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。如果梳子大且角锐利，应该离模具底部远些，以防拔梳子时将凝胶底部拔穿。,11,3上样电泳 将胶两头粘胶纸揭去，移入电泳槽，梳子一侧靠近操作者，注入1TBE缓冲液，浸没凝胶，轻轻拔出梳子。接上电源：阳极远离上样孔，阴极靠近上样孔（DNA向阳极移动）。加4ul上样缓冲液入酶切反应液，混匀，插入冰内。加2ul上样缓冲液入10ul小量制备的重组质粒，混匀，插入冰内。上样次序：由右向左。第1孔：5ul标准品梯度DNA，第2孔：
6、12ul未经切割的重组质粒DNA，第36孔：24ul含上样缓冲液的酶切反应液。加样时，加样头尖端插入上样孔内1/3高度，轻轻将样品推入，使比重较大的样品自然沉入上样孔底。避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部（幻灯）。开启电源，电压调至100V。通常半小时后检查。,12,13,实验结果置凝胶于长波紫外透射仪上，可见清晰的呈淡橘红色的标准品若干梯度条带、一条对应于20002500bp的未被切割的环状含插入片段的质粒和分别对应于250bp和3000bp的两条DNA条带。前面一条约250bp的DNA条带即放大了的插入DNA片段，后面一条为线状的质粒DNA。,14,15,注意事项1若所制备的质粒不能被内切酶切
7、割，可用酚/氯仿抽提一次。2如前所述，一些限制性内切酶对乙醇敏感，比如EcoR I。一旦样品有痕量乙醇污染，会引起酶的失活，难以切开DNA。此时，可以将样品试管开盖，置于70干浴器中若干分钟，使乙醇逐渐挥发，这样十分有效。,16,3常见错误（1）溶解凝胶时，凝胶沸腾后立即外溢。因此，加热溶解凝胶时操作人员不能离开。（2）上样的错误：前后左右和底部的凝胶被刺破，样品漏掉或电泳条带的形态不好。尤其是底部刺穿，样品遗失十分可惜。形成原因是没有经验和手法不好。介绍手法。另外，样品温度过高或上样缓冲液含量不够，比重不够，上样时样品漂浮起来，溢出孔外。,17,（3）电极放反。有时电极没有放反，但接入电源时
8、被接反，结果一样，使DNA样品倒迁徙，立即移出凝胶，工作失败。因此，建议电泳前仔细检查，电泳一段时间后，观察染料确实向前移出后，方可离开。（4）电泳时间过头。电泳时间通常视分离片段的大小而定，一般为半小时至1小时。如果电泳时间过长，目的DNA可能会迁移出凝胶外，实验失败。因此建议使用定时器或含有定时功能的电泳电源。,18,（5）凝胶自灌胶模具上滑落下来。由于观察电泳结果要将凝胶自灌胶模具推移至紫外透射仪上，且往往紫外透射仪安放在暗室，这样需要将凝胶自电泳槽中移出，搬迁。在此过程中容易发生凝胶自灌胶模具上滑落。避免的方法是以食指抵在灌胶模具槽的一端，槽向食指倾斜，使凝胶靠在食指上，左右由于有槽的
9、两侧侧壁护着，保证凝胶不致滑落。（6）凝胶滑入电泳缓冲液。当紫外透射观察后，如果不同片段的分离尚不彻底，需要进一步电泳时，要将凝胶放回电泳槽。此时，凝胶因脱离过模具，粘附不紧，容易自模具中滑入槽内的电泳缓冲液中。若未及时发现，通电后会造成DNA迁徙出凝胶。因此要求凝胶确保未移动后方可通电继续电泳。,19,（7）凝胶浓度不对。过浓或过稀。介绍手册上的方法：大约小片段（100bp左右）用2%左右凝胶，大片段（500bp以上）用1%左右，可以用到0.8%。（8）电泳缓冲液比例或内容不对，偶尔也可以见到。4电泳后的DNA条带会在凝胶中自行扩散，因此要求电泳后立即观察，以免条带扩散。,20,实验 5 从
10、凝胶中回收DNA,21,目 的从凝胶中回收DNA是分子生物学中经常要做的工作。为此，已发展了许多方法，比如：（1）低熔点凝胶。（2）透析袋电泳分离。（3）凝胶挖槽电泳分离。（4）S&S NA45 DEAE膜DNA分离与回收。该方法回收率高，且具有很高的纯度（教材上有详细介绍）。（5）用QIAquick Gel Extraction Kits回收凝胶中的DNA。该方法效率高、所回收DNA的纯度高，且能大大缩短了实验的时间，业已形成产品。我们予以介绍。,22,第一次使用前，在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙醇。所有工作均在室温下进行。,23,操作步骤 1将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽
11、量切除多余部分），放入干净的离心管中，称取重量。2加入3倍体积溶胶液PN（如果凝胶重0.1g，其体积可视为100ul，加入300500ul溶胶液），50水浴放置10分钟。期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解（若胶块过大，请事先切碎）。3试管恢复至室温。4加入10ul 3M NaAC，混匀，室温下10分钟。5将此溶液加入一个吸附柱，下置收集管，13000rpm离心30秒。倒掉收集管中的废液，将吸附柱再次插上收集管。,24,25,6向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱再次插上收集管。7向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，13000rpm离心2分钟。将吸附柱置于室温或50温箱中数分钟，彻底晾干（若漂洗液有残留会影响回收效率和质量）。8将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20ul 6570预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。13000rpm离心1分钟收集DNA溶液。9为提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回同一离心吸附柱中，重复以上步骤8。,26,Thanks,
